Funcional e morfológica de Avaliação de Diafragma Innervation por frênico Neurônios Motores
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) é uma doença debilitante neurónio motor associado com a perda de ambos os neurónios motores superiores e inferiores e consequente paralisia muscular. Após o diagnóstico, a sobrevida do paciente é, em média, apenas 2-5 anos 1. Frênico perda do neurônio motor (PhMN) é um componente crítico da patogénese da ALS. Os pacientes morrem em última análise, devido à perda de PhMN inervação do diafragma, o músculo primário de inspiração 2,3. Traumática lesão medular (LM) é também um problema grave com dificuldades respiratórias associadas. Aproximadamente 12.000 novos casos de SCI ocorrem cada ano 4 devido a danos traumáticos à medula espinal. Apesar da heterogeneidade da doença no que diz respeito à localização, tipo e gravidade, a maioria dos casos de SCI envolver trauma da medula espinhal cervical, o que muitas vezes resulta em compromisso respiratório debilitante e persistente. Além de ALS e SCI, outra doenças do sistema nervoso central (SNC) pode ser associado wdisfunção respiratória diafragmática om 5,6.
O nervo frênico é um nervo motor eferente que inerva o hemi-diafragma ipsilateral e que se origina a partir de corpos celulares PhMN localizados nos níveis de C3-C5 do ipsilateral medula espinhal cervical. PhMN saída é controlado pelo descendente de entrada bulbospinal do tronco cerebral em uma área conhecida como o grupo rostral ventral respiratória (rVRG) 7. O circuito rVRG-PhMN-diafragma é fundamental para o controle da respiração inspiratória, assim como outros comportamentos de diafragma não-ventilatórios. Vários ferimentos traumáticos e doenças neurodegenerativas que afectam este circuito pode levar a uma profunda diminuição da função respiratória e qualidade de vida do paciente. Descendente de entrada para PhMNs da sobrevivência rVRG, PhMN, a integridade do nervo frênico e inervação adequada na junção neuromuscular do diafragma (MNJ) são todos necessários para a função diafragma normal. Por conseguinte, é importante que empregam técnicaspode avaliar quantitativamente este circuito in vivo em modelos de roedores de ALS, SCI e outras doenças do SNC.
Com este protocolo, o objetivo é descrever ferramentas experimentais para avaliar PhMN inervação do diafragma tanto no eletrofisiológico e níveis morfológicos. Potenciais de ação muscular composto (MCs) são registadas ao estimular todos os axônios do neurônio motor eferente de um determinado nervo motor e, em seguida, analisar a resposta despolarização elicitada dos myofibers alvo. Esta técnica pode ser utilizado in vivo em ratos anestesiados e ratos para quantificar inervação funcional da hemi-diafragma por PhMNs 8. Devido ao facto de CMAPs representam gravação simultânea de todos (ou pelo menos a maioria) de muitos / miofibras de todo o hemi-diafragma, que é também útil para analisar os fenótipos de axónios motores individuais e miofibras no MNJ diafragma, a fim de controlar a doença – e terapia relevantes alterações morfológicas, tais como parcial e complete desnervação, surgimento de regeneração e reinervação. Isto pode ser conseguido através de toda a montagem imuno-histoquímica (IHQ) do diafragma, seguido por avaliação morfológica detalhada de NMJs individuais em todo o músculo 9. Combinando CMAPs e análise MNJ fornece uma abordagem poderosa para estudar quantitativamente inervação do diafragma em modelos de roedores de doença do SNC e SNP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como a função respiratória é comprometida em ambos traumático SCI e ALS, desenvolver terapias que visem a respiração e, especificamente, a inervação do diafragma são clinicamente relevantes 5,6. A fim de estudar de forma abrangente função respiratória, deve ser utilizado um método de abordagem combinada. CMAPs medir o grau de inervação funcional do diafragma por meio da estimulação do nervo frênico externo, mas o impulso respiratório bulbospinal não endógeno 8. Além disso, es…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
