横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、上位と下位運動ニューロンとその結果としての筋肉麻痺の両方の損失に関連する衰弱運動ニューロン疾患です。診断時には、患者の生存率は、平均でのみ2〜5年1です。横隔膜運動ニューロン（PhMN）の損失は、ALSの病因の重要なコンポーネントです。患者は、最終的には、振動板のPhMN神経支配、インスピレーション2,3の主要な筋肉の損失に起因する死亡します。外傷性脊髄損傷（SCI）は、関連する呼吸困難の深刻な問題です。 SCIの約12,000の新しい症例が原因で脊髄への外傷性損傷に毎年4起こります。場所、種類及び重症度に対する疾患の不均一性にもかかわらず、SCIの症例の大部分は、多くの場合、衰弱し、永続的な呼吸障害をもたらす頸髄に外傷を伴います。 ALSおよびSCIに加えて、他の中枢神経系（CNS）疾患は、W関連付けることができi番目の横隔膜呼吸不全5,6。
横隔神経は、同側半ダイアフラムを神経支配し、それは同側頸髄のC3-C5レベルに位置PhMN細胞体から発生する遠心性運動神経です。 PhMN出力は吻側腹呼吸器グループ（rVRG）7として知られているエリアに脳幹から延髄脊髄の入力を降順によって制御されます。 rVRG-PhMNダイアフラム回路は、吸気呼吸の制御、ならびに他の非換気ダイヤフラムの動作の中心です。この回路に影響を与える様々な外傷と神経変性疾患は、呼吸機能および患者の生活の質の顕著な低下につながることができます。ダイヤフラム神経筋接合部（NMJ）でrVRG、PhMN生存、横隔神経の整合性と適切な神経支配からPhMNsに入力を降順通常の絞り機能に必要なすべてのです。これは、技術を使用することが重要であること定量的ALS、SCIおよび他のCNS 疾患のげっ歯類モデルにおいてインビボでこの回路を評価することができます。
このプロトコルでは、目標は、電気生理学的および形態学的レベルの両方で振動板のPhMN神経支配を評価するための実験的なツールを記述することです。複合筋活動電位（CMapを）指定された運動神経の全ての遠心性運動ニューロンの軸索を刺激した後、ターゲットの筋線維の脱分極誘発さの応答を分析することによって記録されています。この技術は、PhMNs 8半横隔膜の神経支配の機能を定量化するために麻酔したラットおよびマウスにおいてインビボで使用することができます。原因CMapを、すべての同時記録（あるいは、少なくとも、多くの/ほとんどの）全体の半横隔膜の筋線維を表すという事実のために、それはまた、疾患を追跡するために、絞りNMJで、個々の運動軸索と筋線維の表現型を調べるために有用です – このような部分やcompleなどと治療関連の形態学的変化TE除神経、再生発芽および再支配。これは筋肉9を通して個々のNMJの詳細な形態学的評価に続いて、振動板の全体マウント免疫組織化学（IHC）を介して達成することができます。 CMapをを組み合わせ、NMJ分析は、定量的にCNSおよびPNS疾患の齧歯類モデルで横隔膜神経支配を研究するための強力なアプローチを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
呼吸機能が呼吸、特に絞り神経支配を標的治療法の開発、外傷性SCIとALSの両方に妥協されるように、臨床的に5,6に関連しています。総合呼吸機能を研究するために、組み合わされたアプローチの方法が使用されるべきです。 CMapを外部の横隔神経刺激を介して振動板の機能神経支配の程度を測定するが、延髄脊髄の呼吸ドライブ8内因性ではありません。また、これらの記録は…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
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