<em> במבחנה</em> תרדמת דגם של סרטן השד רגיש לאסטרוגן במוח העצם: כלי ללימודי מנגנון מולקולרי והשערת דור

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

תאי סרטן שד גרורות למוח העצם לפני שהמחלה היא ¹ לזיהוי, ברגע שגידולים קטנים לפתח כלי דם ^2,3. התהליך גרורתי הוא מהיר אבל לא יעיל. תאים להיכנס לכלי הדם החדשים במהירות, במיליון ליום ⁴ אבל כמה לשרוד את המסע לאיברים מרוחקים ^5. עם זאת, כמה micrometastases לשרוד בעצמות ובניתן למצוא כתאים בודדים או גושי תא קטנים בaspirates מח עצם של חולים שאובחנו לאחרונה ^1. תאים אלה להתנגד כימותרפיה אדג'ובנט, המנוהלת למטרה מאוד של חיסולם ^6. התנגדות זו היא ניחן, באופן משמעותי, על ידי הישרדות איתות ביוזמת אינטראקציות עם מייקרו-סביבת מח עצם ^7,8. ניתן למצוא Micrometastases בכשליש מהנשים עם סרטן השד מקומי ומייצג מחוון עצמאי של הישרדות כאשר נותח על ידי ניתוח שונה ^9. microme חלקtastases הוא צמיחה יזם, אבל דפוסי הישנות תלויים בסוג התא. חולים עם סרטן השד שלילי משולש נוטים לחזור על עצמה בין 1 עד 4 שנים, המצביעה על שליטה על עניי המצב הרדום. סוגי תאים אחרים, כוללים ER / PR + תאים, יכולים להישאר רדומים במשך עד 20 שנים, עם קצב קבוע, מתמשך של הישנות ^10. בעוד הבדלים בחתימות ביטוי גני תרדמת בין ER + וקווי ER- שד תא וגידולים משקפים פוטנציאל תרדמת שונה ^11, אינטראקציות עם סטרומה מח עצם עשויים לייצג תרומה משמעותית לתרדמת.

המחקר של תרדמת in vivo הוא קשה במיוחד כי micrometastases הם נדירים ועלו במספרם על ידי תאי hematopoietic על ידי יותר מ 10 ⁶ -fold. לפיכך, מודלים רלוונטיים חייבים להיות שנוצרו המספקים נתונים במבחנה שיכול להציע מנגנונים וליצור השערות הניתנות לבדיקת in vivo. מספר דגמי תרדמת, כולל מתמטי עבור מערךמודלים מתמטיים ^12,13, במבחנה מודלים ^7,8,14,15, המודלים xenograft in vivo ^16, שילובים של במבחנה ומודלי xenograft ^17,18 ומודלי גידול וגרורים ספונטניים ^19, הניבו כמה תובנות תאים סרטניים תרדמת ²⁰ . בכל אחד מהמודלים האלה המגבלות שלהם והם בעצמם בעיקר שימושיים ליצירת השערות בנוגע לאיתות ואינטראקציות ששולטות תרדמת להיבדק במודלים יותר מבחינה ביולוגית מולקולריות רלוונטיים.

עם המטרה הכללית של הגדרת המנגנונים המולקולריים של תרדמת, אינטראקציות עם מייקרו-הסביבה שגורמת לעצירת מחזור, redifferentiation והתנגדות ומנגנונים טיפוליים שתגרומנה לחזרה בER + תאים, שפיתחנו מודל במבחנה שמספקת נבחר אלמנטים רלוונטיים של מייקרו-סביבת סטרומה ^7. מודל זה, תוך דליל יחסית בcomponents, הוא מספיק חזק כדי לאפשר לחוקרים להפיק מנגנונים מולקולריים ספציפיים המשפיעים על פונקציות משמעותיות של תרדמת. ניסויים אלה ליצור השערות שניתן לבדוק ישירות in vivo. המודל מסתמך על כמה אלמנטים מרכזיים שהפגנו להיות רלוונטי בתרדמת. הם כוללים את השימוש בתאי סרטן השד תלוי באסטרוגן, התרבות של תאים בצפיפות clonogenic בו האינטראקציה שלהם היא בעיקר בתשתית ורכיבים מסיסים של המדיום, תשתית פיברונקטין ואת הנוכחות של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF-2) בטווח הבינוני.

אנו מאופיינים מנגנונים ששולטים במערכת במבחנה, כולל האינדוקציה של עצירת מחזור התא על ידי FGF-2 ^21, בתיווך באמצעות ²² TGFβ, הישרדות איתות באמצעות PI3 קינאז ^7,8 וERK ⁸ ובידול morphogenic לפנוטיפ אפיתל, שהיה תלוי ב איון RhoA, integrin45; 5β1 upregulation וקשירה של פיברונקטין סטרומה הישרדות ^7,15 (איור 1). האפקטים במבחנה מחזור תא של FGF-2 על MCF-7 תאים מתחילים בריכוזים יומן אחד לפחות מתחת ל -10 ננוגרם / מיליליטר ^21,23. הרציונל היה מבוסס על השליטה הזמנית של FGF-2 ביטוי שלטון המורפוגנזה החלב ductal, הרחבה מחזורית ומיתון במספר מערכות יונקים ^24-27. אנחנו הוכחנו כי FGF-2 גורם בידול, כוללים המורפוגנזה ductal בתרבות 3D ^28, ושFGF-2 ביטוי, בדרך כלל, איבד עם שינוי ממאיר של גידולים אנושיים ^29. הביטוי של FGR1 נותר על כנן בקרצינומה של שד שהשתתף בסקר ²⁹ וMCF-7 תאים ממשיכים לבטא את כל 4 קולטני FGF ^30. בהקשר של תרדמת, FGF-2 מיוצאים על ידי ושהופקדו בכבדות על סטרומה מח עצם ^31,32 שבו מתפקדת בשימור תאי גזע hematopoietic ^33. אנו demonstrated שFGF-2 גורם למצב רדום בתאי ER + סרטן השד בתרבית על substrata פיברונקטין, גם בשפע במוח, שם הוא גורם לבידול morphogenic ^7. במודל, תאי סרטן השד הם גידול עכבות, להשבית Rho באמצעות גרף RhoGap, redifferentiate לפנוטיפ אפיתל מחדש מפורש lost α5β1 integrins עם התקדמות ממארת. הם נקשרים פיברונקטין דרך α5β1 integrin ולהפעיל הישרדות איתות שהופך אותם עמידים לטיפול ציטוטוקסיות ^7,8,15 (איור 1). עיכוב של GTPases כיתת Rho כבר הוכיח בעבר כדי לגרום פנוטיפ רדום ^34.

כאן אנו מתארים את הנהלים הספציפיים שיאפשר לחוקרים לקבוע את המודל ולחקור מנגנונים מולקולריים ותאיים ספציפיים המסדירים תרדמת של תאי ER + סרטן השד. בניסויים שהוצגו כאן כדי להמחיש את השימוש במודל, אנו ממוקדים מסלול PI3K (איור 1) עם מעכב Akt ומעכב PI3K וכל בני משפחת Rho (איור 1) עם מעכב פאן-רו וRho קינאז מעכב (סלע).

Protocol

1. Assay clonogenic הכן השעיות תא בודדות של שורות תאי סרטן השד תלוי באסטרוגן תאי MCF-7 וT47D באמצעות הצעדים המפורטים להלן לשאוב את מדיום התרבות (DMEM / 10% חום בסרום / גלוטמין מומת עגל עו?…

Representative Results

ניסויים שנערכו כדי לשחזר את assay. במהלך הניסוי הזמן מוצג באיור 2 א. תאים טופחו על צפיפות clonogenic ביום -1, FGF-2 במדיום חדש מתווסף ביום 0 ותאים בתרבית עד שהיום 6 כאשר הם מוכתמים ומושבות נספרות. כל הפרעות למערכת מנוהלות ביום 3 ב100 כרכי μl ב10x ריכוזים סופיים רצוי. אי?…

Discussion

המודל שלנו מורכב ממספר אלמנטים המרכזיים של תרדמת במח העצם. זה מורכב של אסטרוגן תאים רגישים, שהם הסוג צפוי להישאר רדום במוח לפרקי זמן ממושך ^10, זה מורכב של פיברונקטין, אלמנט מבני עיקרי של מוח, FGF-2, גורם גדילה מסונתז בשפע על ידי סטרומה מח העצם והופקד בכבדות במטריקס ש?…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931