<em> In Vitro</em> Покой Модель Эстроген-чувствительной рака молочной железы в костном мозге: Инструмент для молекулярный механизм исследований и гипотез поколения

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Клетки рака груди метастазы в костном мозге до того, как болезнь обнаруживается ^1, как только небольшие опухоли развиваются кровеносные сосуды ^2,3. Метастатического процесса является быстрое, но неэффективно. Клетки ввести новые кровеносные сосуды быстро, в миллионы за ⁴ дня, но немногие выживают поездку в отдаленные органы ^5. Тем не менее, некоторые микрометастазы выжить в кости и могут быть найдены в виде отдельных клеток или небольших комков клеток в клетках костного мозга от вновь диагностированных пациентов ^1. Эти клетки сопротивляться адъювантной химиотерапии, который находится в ведении именно для устранения их ^6. Это сопротивление наделен, по существу, путем выживания сигнализации по инициативе взаимодействия с микросреды костного мозга ^7,8. Микрометастазы можно найти примерно в одной трети женщин с локализованным раком молочной железы и представляют собой самостоятельную показатель выживания при анализе одномерного анализа ^9. Некоторые micrometastases являются рост инициативе, но узоры рецидивов зависит от типа клеток. Пациенты с тройным негативным раком молочной железы, как правило, повторяются от 1 до 4 лет, предполагая, плохой контроль над неактивном состоянии. Другие типы клеток, в том числе ER / PR + клеток, могут оставаться в состоянии покоя до 20 лет, с постоянным, непрерывным скорости рецидива ^10. В то время как различия в неактивности подписей экспрессии генов между ER + и ER-клеточных линий и опухолей молочной железы отражают различные потенциалы покоя ^11, взаимодействия с стромы костного мозга, вероятно, представляют собой значительный вклад в покое.

Изучение покоя в естественных условиях исключительно трудно, потому что микрометастазы редки и превосходили гемопоэтических клеток более чем на 10-кратно ^6. Следовательно, соответствующие модели должны быть созданы, которые обеспечивают в пробирке данных, которые могут предложить механизмы и генерировать проверяемые гипотезы в естественных условиях. Ряд моделей неактивности, в том числе Matheматическое модели ^12,13, в пробирке моделей ^7,8,14,15, в естественных условиях модели ксенотрансплантатов ^16, комбинации в пробирке и модели ксенотрансплантата ^17,18 и спонтанные опухоли и метастазирование модели ^19, дали некоторое представление раковых клеток покоя ²⁰ , Каждая из этих моделей имеет свои ограничения и сами по себе, прежде всего, полезен для генерации гипотез относительно молекулярной сигнализации и взаимодействий, которые регулируют покоя, чтобы быть проверены в более биологически соответствующих моделей.

С общей цели определения молекулярных механизмов покоя, взаимодействия с микросреды, что приводит к цикла ареста, повторной дифференцировки и терапевтического сопротивления и механизмов, которые приводят к рецидиву в ER + клеток, мы разработали модель в пробирке, что обеспечивает выбранный соответствующие элементы стромальных микросреда ^7. Эта модель, в то время как относительно редкие в его компоненты, достаточно прочный, чтобы разрешить следователям, чтобы получить конкретные молекулярные механизмы, которые влияют на важные функции покоя. Эти эксперименты генерации гипотез, которые могут быть проверены непосредственно в живом организме. Модель опирается на несколько ключевых элементов, которые мы продемонстрировали, что отношение в покое. Они включают в себя использование эстроген-зависимых клеток рака молочной железы, культуры клеток на более клоногенном плотности, где их взаимодействие в первую очередь с субстратом и растворимыми компонентами среды, фибронектином субстрат и при наличии основного фактора роста фибробластов (FGF-2) в среде.

Мы охарактеризовали механизмы, которые регулируют систему в пробирке, в том числе индукции ареста клеточного цикла по FGF-2 ^21, опосредованного TGF-beta ^22, выживание сигналов через PI3 киназы ^7,8 и ⁸ Эрк и морфогенного дифференциации в эпителиальной фенотипа, который зависит от RhoA инактивации, интегрину45; 5β1 регуляция и перевязка стромы фибронектина за выживание ^7,15 (Рисунок 1). Эффекты в пробирке клеточного цикла FGF-2 на MCF-7 клетки начинают при концентрации, по меньшей мере одно бревно ниже 10 нг / мл ^21,23. Обоснованием была основана на временной контроль FGF-2, регулирующего экспрессию молочной протоков морфогенез, циклический расширение и спад в ряде систем млекопитающих ^24-27. Мы показали, что FGF-2, индуцирует дифференциацию, в том числе протоковой морфогенеза в 3D культуры ^28, и что FGF-2 экспрессии, как правило, теряется со злокачественной трансформации человеческих опухолей ^29. Выражение FGR1 остались нетронутыми в раке груди опрошенных ²⁹ и MCF-7 клетки продолжают выражать все 4 FGF рецепторы ^30. В контексте покоя, FGF-2 экспортируется и в значительной степени на хранение на стромы костного мозга ^31,32, где она функционирует в сохранении гемопоэтических стволовых клеток ^33. Мы демonstrated, что FGF-2 индуцирует состояние покоя в ER + клеток рака молочной железы, культивированных на субстратах, фибронектина и обильной в мозге, где он вызывает морфологическую дифференциацию ^7. В модели, клетки рака молочной железы являются рост ингибируется, инактивируют Rho A через RhoGAP Граф, чтобы повторно дифференцировать эпителиального фенотипа, и повторно экспресс интегринов α5β1 lost со злокачественной прогрессии. Они связывают фибронектин через интегринового α5β1 и активировать выживание понять, что делает их устойчивыми к цитотоксической терапии ^7,8,15 (рис 1). Ингибирование Rho класса GTPases была продемонстрирована ранее, чтобы побудить покоя фенотипа ^34.

Здесь мы будем наметить конкретные процедуры, которые позволят следователям установить модель и изучать конкретные молекулярные и клеточные механизмы, регулирующие дремоту ER + клеток рака молочной железы. В экспериментах, представленных здесь, чтобы проиллюстрировать использование моделиМы ориентировались на PI3K пути (рис 1B) с Akt ингибитора и ингибитора PI3K и всех членов семьи Ро (рис 1B) с ингибитором пан-Ро и (ROCK) ингибитора киназы Rho.

Protocol

1. клоногенности Подготовка одноклеточных суспензий из эстроген-зависимых линий клеток рака молочной железы MCF-7 и T47D клетки, используя шаги, описанные ниже Аспирируйте культуральную среду (DMEM / 10% тепла инактивированной фетальной телячьей сыворотки / глутамин и ручка / стрепт…

Representative Results

Эксперименты проводились резюмировать анализа. Временной ход эксперимента показан на рисунке 2А. Клетки инкубировали при плотности образующих клоны в день -1, FGF-2 в свежей среде добавляют в день 0 и клетки культивируют до 6-й день, когда они окрашивают и колонии подсчитывают. …

Discussion

Наша модель состоит из нескольких ключевых элементов покоя в костном мозге. Он состоит из эстрогена чувствительные клетки, которые являются тип вероятно, будет оставаться в состоянии покоя в мозге в течение длительных периодов ^10, она состоит из фибронектина, ключевой структурны?…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931