Um<em> In Vitro</em> Dormência Modelo de câncer de mama estrogênio-sensíveis na medula óssea: Uma Ferramenta para Estudos Moleculares Mecanismo e Hipótese Geração

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Células de cancro da mama metastizar para a medula óssea antes de a doença é detectável ^1, assim que os tumores se desenvolvem pequenos vasos sanguíneos ^2,3. O processo metastático é rápida, mas ineficiente. Células entram os novos vasos sanguíneos rapidamente, a milhões por dia ^4, mas poucos sobrevivem a viagem para órgãos distantes ^5. No entanto, algumas micrometástases sobreviver no osso e pode ser encontrado como células individuais ou pequenos aglomerados de células nos aspirados de medula óssea de pacientes recentemente diagnosticados ^1. Estas células resistem à quimioterapia adjuvante, que é administrado pela própria finalidade de eliminá-los ^6. Esta resistência é dotado, substancialmente, por sobrevivência sinalização iniciada por interacções com o microambiente da medula óssea ^7,8. Micrometástases pode ser encontrado em cerca de um terço das mulheres com câncer de mama localizado e representam um indicador independente de sobrevida quando analisados ​​por análise univariada ^9. Alguns micrometástases são o crescimento iniciado, mas padrões de retorno depende do tipo de célula. Pacientes com câncer de mama triplo negativo tendem a recorrer entre 1 a 4 anos, sugerindo pobre controle sobre o estado de dormência. Outros tipos de células, incluindo ER / PR +, células podem permanecer dormentes por até 20 anos, com uma taxa constante e contínuo de recorrência ^10. Embora as diferenças em dormência assinaturas de expressão gênica entre ER- linhas de células de mama e tumores ER + e refletem diferentes potenciais de dormência ^11, interacções com estroma da medula óssea provavelmente representam um contributo significativo para a dormência.

O estudo de dormência in vivo é excepcionalmente difícil porque micrometástases são raros e estão em desvantagem por células hematopoiéticas em mais de 10 vezes de ^6. Assim, os modelos relevantes devem ser gerados que fornecem dados in vitro que pode sugerir mecanismos e gerar hipóteses testáveis ​​in vivo. Uma série de modelos de dormência, incluindo mathemodelos matical ^12,13, modelos in vitro, in vivo ^7,8,14,15 modelos de xenotransplante de ^16, combinações de in vitro e modelos de xenotransplante de ^17,18 e tumorais e metástases modelos espontâneos ^19, têm rendido alguns insights sobre a dormência célula cancerosa ²⁰ . Cada um desses modelos têm as suas próprias limitações e são em si principalmente útil para gerar hipóteses sobre a sinalização molecular e interações que regem a dormência a ser testada em modelos mais biologicamente relevantes.

Com o objetivo geral de definir os mecanismos moleculares de dormência, as interações com o microambiente que resulta na paragem do ciclo, rediferenciação e resistência e os mecanismos terapêuticos que resultam em recorrência em células ER +, desenvolvemos um modelo in vitro que fornece selecionado elementos relevantes da estromal microambiente ^7. Este modelo, embora relativamente escassa em seu componentes, é suficientemente robusto para permitir investigadores para derivar mecanismos moleculares específicos que afectam funções significativas de dormência. Estas experiências gerar hipóteses que podem ser directamente testados in vivo. O modelo baseia-se em alguns elementos-chave que demonstraram ser relevante em dormência. Eles incluem a utilização de células de cancro da mama dependentes de estrogénio, a cultura de células a uma densidade clonogénico onde a sua interacção é principalmente com o substrato e os componentes solúveis do meio, um substrato fibronectina e a presença do factor de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2) no meio.

Foram caracterizados os mecanismos que governam o sistema in vitro, incluindo a indução de paragem do ciclo celular por FGF-2 ^21, mediada através de TGFp ^22, a sobrevivência a sinalização através de PI3-quinase ERK ^7,8 e ⁸ e diferenciação morfogénica para um fenótipo epitelial, que dependia RhoA inactivação, integrina45; 5β1 regulação positiva e ligadura de fibronectina do estroma para a sobrevivência ^7,15 (Figura 1). Os efeitos do ciclo celular in vitro de FGF-2 em células MCF-7 em concentrações começam pelo menos um log inferior a 10 ng / mL ^21,23. A lógica baseou-se no controlo temporal da expressão de FGF-2 que regula a morfogénese ductal da mama, de expansão cíclica e recessão em um certo número de sistemas de mamíferos ^24-27. Nós demonstramos que o FGF-2 induz a diferenciação, incluindo morfogénese ductal in cultura 3D ^28, e que a expressão de FGF-2 são geralmente perdido com a transformação maligna de tumores humanos ^29. A expressão de FGR1 permaneceu intacto em carcinomas da mama examinados ²⁹ e MCF-7 de células continuam a expressar todos os quatro receptores de FGF ^30. No contexto da dormência, o FGF-2 é exportada por e fortemente depositado em estroma de medula óssea ^31,32 onde funciona na preservação de células-tronco hematopoiéticas ^33. Nós demmonstrado que o FGF-2 induz um estado dormente em ER + do câncer de mama células cultivadas em substratos fibronectina, também abundantes na medula, onde induz a diferenciação morphogenic ^7. No modelo, as células de cancro da mama são crescimento inibido, inactivar Rho A através do RhoGap Graf, redifferentiate a um fenótipo epitelial e re-express integrinas α5β1 lost com a progressão maligna. Ligam-se fibronectina através integrina α5β1 e activar a sobrevivência de sinalização que torná-las resistentes à terapia citotóxica ^7,8,15 (Figura 1). A inibição de Rho GTPases classe tem sido demonstrado anteriormente para induzir um fenótipo dormente ^34.

Aqui vamos delinear os procedimentos específicos que permitam aos investigadores estabelecer o modelo e estudar os mecanismos moleculares e celulares específicas que regulam a dormência das células ER + do câncer de mama. Nas experiências aqui apresentadas para ilustrar o uso do modelo, Que orientada via PI3K (Figura 1B) com um inibidor Akt e um inibidor de PI3K e todos os membros da família Rho (Figura 1B) com um inibidor da pan-Rho e Rho cinase um (ROCK) inibidor.

Protocol

1. Ensaio clonogénico Preparar um único suspensões de células de linhas celulares do cancro da mama dependentes de estrogénio de células MCF-7 e T47D utilizando os passos descritos abaixo Aspirar o meio de cultura (DMEM / 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo / glutamina e Pen / Strep) a partir de 10 cm do tecido placa de cultura, que é não confluentes mais de 50% com células T-47D MCF-7 ou. Lavar com PBS. Incubar com tripsina a 0,25% / EDTA 2,21 mM dissolvido em DMEM de alto teor d…

Representative Results

As experiências foram conduzidas de recapitular o ensaio. O curso do tempo da experiência é mostrado na Figura 2A. As células são incubadas a densidade clonogénico no dia -1, é adicionado FGF-2 em meio fresco no dia 0 e as células são cultivadas até ao dia 6, quando eles são coradas e as colónias são contadas. Quaisquer perturbações do sistema são administrados no dia 3 em volumes de 100 uL a 10X a concentração final desejada. A Figura 2B mostra a aparência típ…

Discussion

O nosso modelo é composta por vários elementos chave de dormência na medula óssea. É composto de estrogénio células sensíveis, que são do tipo susceptíveis de permanecer dormentes na medula por períodos prolongados ^10, que consiste de fibronectina, um elemento estrutural chave da medula, o FGF-2, um factor de crescimento abundantemente sintetizado pelo estroma da medula óssea e fortemente depositado na matriz extracelular da medula óssea ^31,32 e incubação de células clonogénicas, e…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931