ل<em> في المختبر</em> الخمول نموذج من الاستروجين تراعي سرطان الثدي في نخاع العظام: أداة للدراسات الآلية الجزيئية والجيل الفرضية

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

خلايا سرطان الثدي metastasize إلى نخاع العظم قبل المرض قابلا للاكتشاف ^1، في أقرب وقت تتطور الاورام الصغيرة الأوعية الدموية ^2،3. عملية النقيلي سريعا ولكن غير فعالة. الخلايا تدخل الأوعية الدموية الجديدة بسرعة، في ملايين في اليوم الواحد ⁴ ولكن قلة البقاء على قيد الحياة في رحلة إلى أعضاء بعيدة ^5. ومع ذلك، فإن بعض micrometastases البقاء على قيد الحياة في العظام ويمكن العثور عليها كما الخلايا واحد أو كتل الخلايا الصغيرة في شفاطات نخاع العظام من المرضى الذين شخصت حديثا ^1. هذه الخلايا تقاوم العلاج الكيميائي المساعد، والتي تدار لغرض جدا القضاء عليها ^6. وهبت هذه المقاومة، إلى حد كبير، من خلال بقاء الإشارات التي بدأها التفاعل مع نخاع العظام المكروية ^7،8. Micrometastases يمكن العثور عليها في حوالي ثلث النساء المصابات بسرطان الثدي الموضعي وتمثل مؤشرا مستقلا من البقاء على قيد الحياة عند تحليلها عن طريق التحليل وحيد المتغير ^9. بعض micrometastases ل بنمو بدأت، ولكن تعتمد أنماط تكرار على نوع من الخلايا. المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي ثلاثي السلبية تميل إلى تتكرر بين 1-4 سنوات، مما يشير إلى ضعف السيطرة على حالة سبات. أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك ER / PR + الخلايا، يمكن أن تظل كامنة لمدة تصل إلى 20 عاما، مع مطرد وبمعدل المستمر من تكرار ^10. في حين الاختلافات في السكون التوقيعات التعبير الجيني بين ER + وER- خطوط خلايا الثدي والأورام تعكس إمكانات السكون مختلفة ^11، والتفاعلات مع نخاع العظم سدى المرجح تمثل مساهمة كبيرة في السكون.

دراسة السكون في الجسم الحي هي صعبة للغاية بسبب micrometastases نادرة وفاق عدد من الخلايا المكونة للدم بأكثر من 10 ⁶ أضعاف. وبالتالي، لا بد من إنشاء النماذج ذات الصلة التي تقدم في بيانات المختبر التي يمكن اقتراح آليات وتوليد فرضيات قابلة للاختبار في الجسم الحي. وهناك عدد من النماذج السكون، بما في ذلك ماثينماذج matical ^12،13، في المختبر نماذج ^{7،8،14،15،} في النماذج الحية طعم أجنبي ^16، مزيج من في المختبر ونماذج طعم أجنبي ^17،18 والورم والانبثاث نماذج عفوية ^19، وقد أسفرت بعض التبصر الخلايا السرطانية السكون ²⁰ . كل هذه النماذج لدينا القيود الخاصة بها وهي في حد ذاتها مفيدة في المقام الأول لتوليد الفرضيات بشأن الإشارات الجزيئية والتفاعلات التي تحكم السكون لفحصها في أكثر النماذج ذات الصلة بيولوجيا.

مع الهدف العام المتمثل في تحديد الآليات الجزيئية من السكون، والتفاعل مع المكروية التي تؤدي إلى اعتقال دورة، عودة التمايز والمقاومة والآليات العلاجية التي تؤدي إلى تكرار في ER + الخلايا، وضعنا نموذجا في المختبر أن يوفر اختيار العناصر ذات الصلة من انسجة المكروية ^7. هذا النموذج، في حين متفرق نسبيا في كومبو لnents، هو قوي بما فيه الكفاية للسماح للمحققين لاستخلاص الآليات الجزيئية المحددة التي تؤثر على وظائف كبيرة من السكون. هذه التجارب تولد الفرضيات التي يمكن اختبارها بشكل مباشر في الجسم الحي. ويعتمد هذا النموذج على عدد قليل من العناصر الرئيسية التي أثبتنا أن تكون ذات صلة في السكون. وهي تشمل استخدام خلايا سرطان الثدي تعتمد على هرمون الاستروجين والثقافة من الخلايا في مناطق ذات كثافة مولد الرمع حيث تفاعلها هو في المقام الأول مع التحتية ومكونات قابلة للذوبان من المتوسط، وهو التحتية فبرونيكتين وجود عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (FGF-2) في المتوسط.

نحن تتميز الآليات التي تحكم النظام في المختبر، بما في ذلك تحريض اعتقال دورة الخلية التي كتبها FGF-2 ^21، بوساطة من خلال TGFβ ²² والبقاء يشير من خلال PI3 كيناز ^7،8 و ⁸ ERK والتمايز morphogenic إلى النمط الظاهري الظهارية، التي تعتمد على RhoA تعطيل، إنتغرين45؛ 5β1 upregulation وربط فبرونيكتين انسجة من أجل البقاء ^7،15 (الشكل 1). الآثار في المختبر دورة الخلية من FGF-2 على MCF-7 الخلايا تبدأ في تركيزات سجل واحد على الأقل أقل من 10 نانوغرام / مل ^21،23. واستند المبرر على السيطرة الزمنية للFGF-2 التعبير التي تحكم الثديية التشكل الأقنية، والتوسع دوري والركود في عدد من النظم الثدييات ^24-27. أثبتنا أن FGF-2 يدفع التمايز، بما في ذلك التشكل الأقنية في الثقافة 3D ^28، والتي تضيع عادة مع التحول السرطاني للأورام الإنسان ²⁹ FGF-2 التعبير. بقي التعبير عن FGR1 سليمة في سرطان الثدي التي شملتها الدراسة ²⁹ و MCF-7 الخلايا الاستمرار في التعبير عن كل مستقبلات FGF 4 ^30. في سياق السكون، ويتم تصدير FGF-2 التي وأودعت بشكل كبير على نخاع العظم سدى ^31،32 حيث أنه يعمل في الحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم ^33. نحن ماركاonstrated أن FGF-2 يؤدي الى حالة سبات في ER + سرطان الثدي الخلايا المستزرعة على الطبقات التحتية فبرونيكتين، وفيرة أيضا في نخاع، حيث يدفع التمايز morphogenic ^7. في هذا النموذج، خلايا سرطان الثدي ل بنمو مستعمل، تعطيل رو A من خلال RhoGap غراف، redifferentiate إلى النمط الظاهري الظهارية وإعادة اكسبريس integrins α5β1 lost مع تطور خبيث. أنها تربط الفيبرونكتين من خلال إنتغرين α5β1 وتفعيل البقاء على قيد الحياة مما يشير إلى أن تجعلها مقاومة للعلاج السامة للخلايا ^7،8،15 (الشكل 1). وقد تجلى تثبيط GTPases الدرجة رو سابقا للحث على النمط الظاهري نائمة ^34.

ونحن هنا سوف الخطوط العريضة لإجراءات محددة من شأنها أن تسمح للمحققين لإنشاء نموذج ودراسة الآليات الجزيئية والخلوية المحددة التي تحكم السكون من ER + سرطان الثدي الخلايا. في التجارب المقدمة هنا لتوضيح استخدام نموذج، نحن استهدف مسار PI3K (الشكل 1B) مع مثبط AKT ومثبط PI3K وجميع أفراد الأسرة رو (الشكل 1B) مع مثبط لعموم رو رو وكيناز (ROCK) المانع.

Protocol

1. فحص مولد الرمع إعداد تعليق خلية واحدة من خطوط خلايا سرطان الثدي تعتمد على هرمون الاستروجين خلايا MCF-7 وT47D باستخدام الخطوات المبينة أدناه نضح مستنبت (DMEM / 10٪ الحرارة الم…

Representative Results

وأجريت التجارب أن ألخص الفحص. يظهر مدار الساعة من التجربة في الشكل 2A. يتم تحضين الخلايا في كثافة مولد الرمع يوم -1، يضاف FGF-2 في متوسطة جديدة في اليوم 0 ويتم استزراع خلايا حتى يوم 6 عندما الملون أنها وتحسب المستعمرات. تدار أي اضطرابات للنظام في يوم 3 في 100 مجلدا…

Discussion

يتكون لدينا نموذج من عدة عناصر أساسية من السكون في نخاع العظام. وهو يتألف من الاستروجين الخلايا الحساسة، والتي هي نوع من المرجح أن تظل كامنة في نخاع لفترات طويلة ^10، وتتكون من فبرونيكتين، وهو العنصر الهيكلي الرئيسي للنخاع، FGF-2، وهو عامل نمو توليفها بوفرة من قبل ?…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931