En<em> In vitro</em> Vækstdvale Model af østrogen-følsomme brystkræft i knoglemarven: Et værktøj for molekylære mekanisme Studier og Hypotese Generation

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Bryst kræftceller metastaserer til knoglemarven før sygdommen er detekterbar ^1, så snart små tumorer udvikle blodkar ^2,3. Den metastatiske proces er hurtig men ineffektiv. Celler indtaste nye blodkar hurtigt på millioner per dag ^4, men kun få overlever turen til fjerne organer ^5. Ikke desto mindre, nogle mikrometastaser overleve i knoglen og kan findes som enkelte celler eller små celleklumper i knoglemarvsaspirater fra nydiagnosticerede patienter ^1. Disse celler modstå adjuverende kemoterapi, som administreres for selve formålet med at fjerne dem ^6. Denne modstand er udstyret, betydeligt, ved at overleve signalering initieret af interaktioner med knoglemarvens mikromiljø ^7,8. Mikrometastaser kan findes i omkring en tredjedel af kvinder med lokaliseret brystcancer og udgør en uafhængig indikator for overlevelse ved analyse ved univariate analyse ^9. Nogle micrometastases er vækst indledt, men tilbagefald mønstre afhænger af celletype. Patienter med kræft triple negativ brystkræft tendens til at gentage sig på mellem 1 til 4 år, hvilket tyder på dårlig kontrol over sovende tilstand. Andre celletyper, herunder ER / PR + celler, kan forblive i dvale i op til 20 år, med en stabil, kontinuerlig sats for fornyet ^10. Mens forskelle i hviletilstand genekspression signaturer mellem ER + og ER- bryst cellelinjer og tumorer afspejler forskellige hviletilstand potentialer ^11, interaktioner med knoglemarvsstroma sandsynligvis udgør et væsentligt bidrag til hviletilstand.

Studiet af hviletilstand in vivo er usædvanligt vanskeligt, fordi micrometastases er sjældne og er undertal hæmatopoietiske celler med mere end 10 ⁶ fold. Derfor skal de relevante modeller genereres der giver in vitro data, der kan foreslå mekanismer og generere testbare hypoteser in vivo. En række hviletilstand modeller, herunder Mathematisk modeller ^12,13, in vitro modeller ^7,8,14,15, in vivo xenograftmodeller ^16, kombinationer af in vitro og xenograftmodeller ^17,18 og spontane tumor og metastase-modeller ^19, har givet et indblik i kræftcellen vækstdvale ²⁰ . Hver af disse modeller har deres egne begrænsninger og er af sig selv primært nyttig til at generere hypoteser vedrørende molekylær signalering og interaktioner, der styrer hviletilstand, der skal testes i mere biologisk relevante modeller.

Med det overordnede mål at definere de molekylære mekanismer i vækstdvale, interaktionerne med mikromiljø, der resulterer i cyklus anholdelse, redifferentiation og terapeutisk modstand og mekanismer, der resulterer i tilbagefald i ER + celler, udviklede vi en in vitro model, der giver udvalgte relevante dele af stromale mikromiljø ^7. Denne model, mens relativt sparsomme i sin komponenter, er tilstrækkeligt robust til at tillade efterforskere til at udlede specifikke molekylære mekanismer, der påvirker væsentlige funktioner vækstdvale. Disse eksperimenter generere hypoteser, der direkte kan testes in vivo. Modellen bygger på et par vigtige elementer, som vi vist sig at være relevant i dvale. De omfatter anvendelse af østrogen-afhængige brystcancerceller, dyrkning af celler ved en klonogen tæthed hvor deres interaktion primært med underlaget og opløselige komponenter i mediet, et fibronectin substrat og tilstedeværelsen af ​​basisk fibroblast vækstfaktor (FGF-2) i mediet.

Vi kendetegnet mekanismer, der styrer systemet in vitro, herunder induktion af standsning af cellecyklus ved FGF-2 ^21, medieret gennem TGFp ^22, overlevelse signalering gennem PI3 kinase ^7,8 og ERK ⁸ og morfogene differentiering til en epitelial fænotype, der afhang af RhoA inaktivering integrin45; 5β1 opregulering og ligering af stromal fibronectin for overlevelse ^7,15 (Figur 1). De in vitro cellecyklus virkninger af FGF-2 på MCF-7-celler begynder ved koncentrationer mindst en log under 10 ng / ml ^21,23. Rationalet var baseret på den tidsmæssige styring af FGF-2-ekspression regulerer mamma ductal morfogenese, cyklisk ekspansion og recession i en række af mammale systemer ^24-27. Vi viste, at FGF-2 inducerer differentiering, herunder duktalt morfogenese i 3D kultur ^28, og at FGF-2-ekspression er generelt tabt med malign transformation af humane tumorer ^29. Ekspressionen af FGR1 forblev intakt i brystcarcinomer adspurgte ²⁹ og MCF-7-celler fortsætter med at udtrykke alle 4 FGF-receptorer ^30. I forbindelse med hvileperioden er FGF-2 eksporteres af og stærkt aflejret på knoglemarvsstroma ^31,32 hvor det fungerer på bevarelsen af hæmatopoietiske stamceller ^33. Vi demonstrated at FGF-2 inducerer en sovende tilstand i ER + brystkræft celler dyrket på fibronectin substrater, også rigeligt i marven, hvor det inducerer morfogen differentiering ^7. I modellen, brystkræftceller er vækst hæmmes, inaktivere Rho A gennem RhoGap GRAF, redifferentiate en epitelial fænotype og re-express integriner α5β1 lost med ondartet progression. De binder fibronectin gennem integrin α5β1 og aktivere overlevelse signalere, at gøre dem resistente over for cytotoksisk terapi ^7,8,15 (figur 1). Inhibering af Rho klasse GTPaser er blevet påvist tidligere at inducere en hvilende fænotype ^34.

Her vil vi skitsere de specifikke procedurer, der vil tillade efterforskerne at etablere modellen og studere specifikke molekylære og cellulære mekanismer, der styrer hviletilstand af ER + brystkræft celler. I eksperimenterne præsenteret her for at illustrere anvendelsen af ​​modellenVi målrettet PI3K pathway (figur 1B) med en Akt inhibitor og en PI3K-hæmmer og alle medlemmer af Rho familie (figur 1B) med en pan-Rho-hæmmer og en Rho-kinase (ROCK) hæmmer.

Protocol

1. klongenicitetsassayet Forberede en enkelt celle suspensioner af østrogenafhængige brystkræft cellelinier MCF-7 og T47D-celler under anvendelse nedenstående trin Aspirer dyrkningsmedium (DMEM / 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum / glutamin og pen / strep) fra en 10 cm vævskulturskål, der er ikke mere end 50% konfluente med MCF-7 eller T-47D-celler. Skyl med PBS. Inkuber med trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA opløst i DMEM høj glucose ved 37 ° C i 1-4 min. Check celler med 1 minuts…

Representative Results

Eksperimenter blev udført for at rekapitulere assayet. Tidsforløbet for eksperimentet er vist i figur 2A. Cellerne inkuberes ved klonogene densitet på dag -1, tilsættes FGF-2 i frisk medium på dag 0, og celler dyrkes indtil dag 6, når de farves, og kolonier tælles. Eventuelle forstyrrelser af systemet administreres på dag 3 i 100 pi volumener på 10x endelige koncentrationer ønskes. Figur 2B viser den typiske udseende voksende og sovende kolonier. Voksende kolonier indeho…

Discussion

Vores model består af flere centrale elementer i vækstdvale i knoglemarven. Den består af estrogen sensitive celler, som er den type, forventes at forblive hvilende i marven i længere perioder ¹⁰ består det af fibronectin, et centralt strukturelt element af marv, FGF-2, en vækstfaktor rigeligt syntetiseret ved knoglemarvsstroma og stærkt deponeret i den ekstracellulære matrix af knoglemarven ^31,32 og inkubation af celler ved klonogen tæthed, hvor deres interaktion primært med underlaget. …

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931