Summary

Ein<em> In-vitro-</em> Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung

Published: June 30, 2015
doi:

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Brustkrebszellen zu metastasieren in das Knochenmark vor der Erkrankung nachweisbar 1, sobald kleine Tumore entwickeln Blutgefße 2,3. Die metastasierendem Verfahren ist schnell, aber ineffizient. Zellen, geben Sie die neuen Blutgefäße schnell, zu Millionen pro Tag 4, aber nur wenige überleben die Reise zu entfernten Organen 5. Dennoch gibt es einige Mikrometastasen zu überleben in den Knochen und kann als einzelne Zellen oder kleine Zellklumpen in Knochenmarkaspirate von neu diagnostizierten Patienten 1 gefunden werden. Diese Zellen wider adjuvante Chemotherapie, die für den Zweck der Beseitigung von ihnen 6 verabreicht wird. Dieser Widerstand wird dotiert, im Wesentlichen durch das Überleben Signalisierung durch Wechselwirkungen mit dem Knochenmark-Mikroumgebung 7,8 eingeleitet. Mikrometastasen in etwa ein Drittel der Frauen mit lokalem Brustkrebs gefunden werden und stellen ein unabhängiges Indikator für das Überleben, wenn sie von univariaten Analyse 9 analysiert. Einige micrometastases sind Wachstum eingeleitet, aber Wiederholungsmuster sind abhängig von Zelltyp. Patienten mit triple negativem Brustkrebs neigen dazu, zwischen 1 bis 4 Jahre wiederkehren, was auf schlechte Kontrolle über die schlafenden Zustand. Andere Zelltypen, einschließlich ER / PR + Zellen können für bis zu 20 Jahre ruhend bleiben, mit einem stetigen, kontinuierlichen Rezidivrate 10. Während Unterschiede in der Keimruhe Genexpressionssignaturen zwischen ER + und ER- Brustzelllinien und Tumoren spiegeln unterschiedliche Ruhepotentiale 11, Interaktionen mit Knochenmarkstroma wahrscheinlich einen bedeutenden Beitrag zur Keimruhe.

Das Studium der Keimruhe in vivo ist außerordentlich schwierig, weil Mikrometastasen sind selten und werden zahlenmäßig von blutbildenden Zellen um mehr als 10 6 -fach. Daher müssen entsprechende Modelle erzeugt werden, die in-vitro-Daten, die Mechanismen vorschlagen, und erzeugen überprüfbare Hypothesen in vivo unterbieten sind. Eine Reihe von Ruhe Modelle, darunter matheatika Modelle 12,13, in-vitro-Modellen 7,8,14,15, in vivo-Xenotransplantat-Modelle 16, Kombinationen von in vitro und Xenotransplantatmodellen 17,18 und spontaner Tumormetastasen und Modelle 19, haben einen Einblick in Krebszellruhe 20 ergab . Jedes dieser Modelle haben ihre eigenen Grenzen und sind von sich selbst in erster Linie sinnvoll zur Erzeugung von Hypothesen zur molekularen Signal und Interaktionen, die Ruhephase, um in mehr biologisch relevanten Modellen getestet werden regieren.

Mit dem Gesamtziel definiert, die molekularen Mechanismen der Keimruhe, die Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung, die in Zyklusarrest, Redifferenzierung und Therapieresistenz und Mechanismen führt, die in Rückfällen bei ER + Zellen führen, ein in vitro-Modell, das ausgewählt relevanten Elemente der bietet entwickelten wir Stroma-Mikroumgebung 7. Dieses Modell, während in seiner Kompo relativ spärlichenten, ist robust genug, um die Ermittler zu ermöglichen, spezifische molekulare Mechanismen, die signifikante Funktionen der Keimruhe beeinträchtigen abzuleiten. Diese Experimente erzeugen Hypothesen, die direkt in vivo getestet werden können. Das Modell stützt sich auf einige Schlüsselelemente, die wir gezeigt, in Keimruhe relevant. Sie umfassen die Verwendung von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zellen, der Kultur von Zellen in einem klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirkung ist hauptsächlich mit der Erde und die löslichen Bestandteile des Mediums, einer Fibronektin-Substrat und das Vorhandensein von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) im Medium.

Wir gekennzeichnet Mechanismen, die das System in vitro regeln, einschließlich der Induktion von Zellzyklusarrest von FGF-2 21, durch TGFß 22 vermittelt wird, das Überleben Signalgebung durch PI3 Kinase ERK 7,8 und 8 und morphogenic Differenzierung zu einer epithelialen Phänotyp, die auf abhing RhoA Inaktivierung Integrin45; 5β1 Hochregulierung und die Ligation von Stromazellen Fibronektin Überleben 7,15 (Abbildung 1). Die in-vitro-Zellzykluseffekte von FGF-2 auf die MCF-7 Zellen beginnen bei Konzentrationen mindestens einer Protokoll unter 10 ng / ml 21,23. Die Begründung wurde auf die zeitliche Steuerung von FGF-2-Expression über Brust-duktales Morphogenese, zyklische Expansion und Rezession in einer Reihe von Säugetiersystemen 24-27 basiert. Wir haben gezeigt, dass FGF-2 induziert die Differenzierung, einschließlich duktalen Morphogenese in 3D-Kultur 28, und dass FGF-2-Expression in der Regel verlor mit malignen Transformation von menschlichen Tumoren 29. Die Expression von FGR1 blieb intakt in befragten 29 und MCF-7 Zellen Mammakarzinomen weiterhin alle 4 FGF-Rezeptoren 30 zum Ausdruck bringen. Im Kontext der Dormanz wird FGF-2 durch exportiert und stark auf Knochenmarkstroma 31,32, wo es bei der Konservierung von Blutstammzellen 33 fungiert abgeschieden. Wir DMonstrated, dass FGF-2 induziert einen Ruhezustand in ER + Brustkrebszellen zu Fibronektin Substraten, auch im Knochenmark, wo es morphogenic Differenzierung 7 induziert reichlich kultiviert. Im Modell Brustkrebszellen sind Wachstum gehemmt wird, inaktivieren Rho A durch die RhoGap GRAF, Redifferenzierung zu einer epithelialen Phänotyp und Re-express Integrine α5β1 lost mit malignen Progression. Sie binden Fibronektin durch Integrin α5β1 und aktiviere das Überleben signalisiert, dass sie resistent gegen zytotoxischen Therapie 7,8,15 (Abbildung 1) zu machen. Hemmung der Rho-GTPasen Klasse wurde bereits gezeigt, dass eine Ruhe Phänotyp 34 induzieren.

Hier werden wir die spezifischen Verfahren, die Ermittler erlauben wird, um das Modell zu etablieren und zu studieren spezifischen molekularen und zellulären Mechanismen, die Ruhephase der ER + Brustkrebszellen zu skizzieren. In den Experimenten hier dargestellt, um die Verwendung des Modells veranschauGezielte wir den PI3K-Weg (1B) mit einem Akt-Inhibitor und einem PI3K-Inhibitor und alle Mitglieder der Rho-Familie (1B) mit einem pan-Rho-Inhibitor und einem Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor.

Protocol

1. Klonogentest Bereiten Sie eine Einzelzellsuspensionen von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7 und T47D-Zellen unter Verwendung der unten angegebenen Schritte, Saugen Sie das Kulturmedium (DMEM / 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum / Glutamin und Pen / Strep) von einer 10 cm Gewebekulturschale, die nicht mehr als 50% konfluent mit MCF-7 oder T-47D-Zellen ist. Spülen mit PBS. Inkubieren mit Trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA in DMEM mit hohem Glucose gelöst bei 37 ° C für 1-4 mi…

Representative Results

Experimente wurden durchgeführt, um den Test zu wiederholen. Der Zeitverlauf des Experiments ist in 2A gezeigt. Die Zellen werden bei klonogenen Dichte am Tag -1 inkubiert wird FGF-2 in frischem Medium am Tag 0 gegeben und die Zellen werden bis zum Tag 6 kultiviert, wenn sie gefärbt sind, und die Kolonien gezählt. Jegliche Störungen in das System werden am Tag 3 in 100 ul-Volumina bei 10-facher Endkonzentration verabreicht gewünscht. 2B veranschaulicht das typische Erscheinun…

Discussion

Unser Modell besteht aus mehreren Schlüsselelemente der Vegetationsruhe im Knochenmark besteht. Es besteht aus Östrogen empfindlichen Zellen, die die Art wahrscheinlich ruhend im Mark längere Zeiträume 10 zu bleiben, sie besteht aus Fibronectin, einem wichtigen Strukturelement der Mark, FGF-2, ein Wachstumsfaktor reichlich durch die Knochenmarkstroma synthetisierten und stark in der extrazellulären Matrix von Knochenmark 31,32 und Inkubation der Zellen bei klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirk…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

MCF-7 cells ATCC HTB-22
T47D cells  ATCC HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate Corning 354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes Corning 354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes Corning 354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin Corning 354088
6 Well tissue culture plate CellTreat 229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder Corning Life Sciences 50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum Serum Source International FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid Corning 25-005-CI
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) CalBiochem 124005
LY294002  CalBiochem 19-142 Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase  Cytoskeleton CTO3 Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride  Santa Cruz Biotechnology 129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)  Molecular Probes B607 Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)  Molecular Probes R415 Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent  Molecular Probes R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI  Molecular Probes P-36931

References

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).
check_url/fr/52672?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Tivari, S., Korah, R., Lindy, M., Wieder, R. An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation. J. Vis. Exp. (100), e52672, doi:10.3791/52672 (2015).

View Video