Un<em> In Vitro</em> Latencia Modelo de cáncer de mama estrógeno-sensibles en la médula ósea: una herramienta de Estudios mecanismo molecular y Hipótesis Generación

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Células de cáncer de mama metástasis en la médula ósea antes de la enfermedad es detectable ^1, tan pronto como los tumores se desarrollan pequeños vasos sanguíneos ^2,3. El proceso metastásico es rápida pero ineficiente. Las células entran en los vasos sanguíneos nuevos rápidamente, en millones por día ⁴ pero pocos sobreviven el viaje a órganos distantes ^5. Sin embargo, algunos micrometástasis sobrevivir en el hueso y se pueden encontrar como células individuales o grupos de células pequeñas en aspirados de médula ósea de los pacientes recién diagnosticados ^1. Estas células resisten a la quimioterapia adyuvante, que es administrado con el propósito de eliminarlas ^6. Esta resistencia está dotado, sustancialmente, por la supervivencia de señalización iniciada por la interacción con el microambiente de la médula ósea ^7,8. Las micrometástasis se pueden encontrar en aproximadamente un tercio de las mujeres con cáncer de mama localizado y representan un indicador independiente de la supervivencia cuando se analizaron por análisis univariado ^9. Algunos micrometastases son el crecimiento iniciado, pero los patrones de recurrencia dependen del tipo de célula. Los pacientes con cáncer de mama triple negativo tienden a repetirse entre 1 a 4 años, lo que sugiere un mal control sobre el estado de latencia. Otros tipos de células, incluyendo las células ER / PR +, pueden permanecer latentes durante un máximo de 20 años, con un ritmo constante y continua de recurrencia ^10. Mientras que las diferencias en la latencia firmas de expresión génica entre ER + y ER- líneas celulares de mama y tumores reflejan diferentes potenciales de latencia ^11, las interacciones con estroma de la médula ósea probablemente representan una contribución significativa a la latencia.

El estudio de la latencia in vivo es excepcionalmente difícil debido a micrometástasis son raros y son superados en número por las células hematopoyéticas en más de un 10 ⁶ -fold. Por lo tanto, los modelos relevantes se deben generar que proporcionan datos in vitro que puede sugerir mecanismos y generar hipótesis comprobables en vivo. Un número de modelos de latencia, incluyendo mathemodelos matemá- ^12,13, en modelos in vitro, in vivo ^7,8,14,15 modelos de xenoinjerto ^16, combinaciones de in vitro y modelos de xenoinjerto ^17,18 y tumoral y la metástasis modelos espontáneos ^19, han producido una cierta penetración en la latencia de células de cáncer ²⁰ . Cada uno de estos modelos tienen sus propias limitaciones y son en sí mismos principalmente útil para generar hipótesis sobre la señalización molecular y las interacciones que rigen la latencia a ensayar en modelos más biológicamente relevantes.

Con el objetivo general de la definición de los mecanismos moleculares de la inactividad, las interacciones con el microambiente que da lugar a la detención del ciclo, rediferenciación y resistencia terapéutica y mecanismos que dan lugar a la recurrencia en las células ER +, hemos desarrollado un modelo in vitro que proporciona selecciona los elementos pertinentes de la estroma microambiente ^7. Este modelo, si bien es relativamente escasa en su componentes, es suficientemente robusto para permitir a los investigadores a derivar mecanismos moleculares específicos que afectan a las funciones significativas de latencia. Estos experimentos generan hipótesis que se pueden probar directamente in vivo. El modelo se basa en una serie de elementos clave que hemos demostrado ser relevante en la latencia. Estos incluyen el uso de células de cáncer de mama dependientes de estrógenos, cultivo de células a una densidad clonogénico donde su interacción es principalmente con el sustrato y los componentes solubles del medio, un sustrato de fibronectina y la presencia de factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGF-2) en el medio.

Hemos caracterizado los mecanismos que gobiernan el sistema in vitro, incluyendo la inducción de la detención del ciclo celular por FGF-2 ^21, mediada a través de TGF ^22, la supervivencia de señalización a través de PI3 quinasa ERK ^7,8 y ⁸ y la diferenciación morfogénica a un fenotipo epitelial, que dependía de RhoA inactivación, la integrina45; 5β1 upregulation y la ligadura de la fibronectina del estroma para la supervivencia ^7,15 (Figura 1). Los efectos del ciclo celular in vitro de FGF-2 en células MCF-7 células comienzan a concentraciones al menos un log por debajo de 10 ng / ml ^21,23. La razón se basa en el control temporal de FGF-2 expresión que rige la morfogénesis ductal mamario, la expansión cíclica y la recesión en un número de sistemas de mamíferos ^24-27. Hemos demostrado que el FGF-2 induce la diferenciación, incluyendo la morfogénesis ductal en la cultura 3D ^28, y que el FGF-2 de expresión se pierden generalmente con la transformación maligna de los tumores humanos ^29. La expresión de FGR1 permaneció intacta en los carcinomas de mama encuestados ²⁹ y MCF-7 células continúan para expresar todos los 4 receptores de FGF ^30. En el contexto de la latencia, FGF-2 se exporta por y fuertemente deposita sobre estroma de médula ósea ^31,32 donde funciona en la preservación de las células madre hematopoyéticas ^33. Nos demonstrated que FGF-2 induce un estado latente en cáncer de mama ER + células cultivadas sobre sustratos de fibronectina, también abundante en la médula ósea, donde se induce la diferenciación morfogénica ^7. En el modelo, las células de cáncer de mama son el crecimiento inhibido, inactivar Rho A través de la RhoGAP GRAF, redifferentiate a un fenotipo epitelial y re-expresa lost integrinas α5β1 con la progresión maligna. Ellos se unen a través de fibronectina α5β1 integrina y activan la supervivencia de señalización que hacerlos resistentes a la terapia citotóxica ^7,8,15 (Figura 1). La inhibición de la Rho GTPasas de clase se ha demostrado previamente para inducir un fenotipo inactivo ^34.

Aquí vamos a esbozar los procedimientos específicos que permitan a los investigadores a establecer el modelo y estudiar los mecanismos moleculares y celulares específicas que regulan la latencia de las células de cáncer de mama ER +. En los experimentos presentados aquí para ilustrar el uso del modelo, Nos centramos en la vía PI3K (Figura 1B) con un inhibidor de Akt y un inhibidor de PI3K y todos los miembros de la familia Rho (Figura 1B) con un inhibidor pan-Rho y un (ROCK) inhibidor de Rho quinasa.

Protocol

1. Ensayo clonogénico Preparar un solo suspensiones de células de líneas celulares de cáncer de mama estrógeno-dependientes células MCF-7 y T47D utilizando los pasos descritos a continuación Aspirar el medio de cultivo (DMEM / 10% inactivado por calor suero fetal de ternera / glutamina y penicilina / estreptomicina) a partir de una placa de cultivo de tejido de 10 cm que es no confluente más de 50% con las células T-47D MCF-7 o. Enjuague con PBS. Incubar con tripsina 0,25% / EDTA 2,21 mM dis…

Representative Results

Se realizaron experimentos para recapitular el ensayo. El curso de tiempo del experimento se muestra en la Figura 2A. Las células se incubaron a densidad clonogénico en el día -1, se añade FGF-2 en medio fresco en días 0 y las células se cultivan hasta el día 6 cuando se tiñen y se cuentan las colonias. Cualquier perturbaciones en el sistema se administran en el día 3 en 100 volúmenes mu l a 10x concentraciones finales deseadas. La Figura 2B muestra la apariencia típica…

Discussion

Nuestro modelo se compone de varios elementos clave de la latencia en la médula ósea. Se compone de células sensibles a estrógenos, que son el tipo propensos a permanecer en estado latente en la médula ósea durante períodos prolongados ^10, se compone de fibronectina, un elemento estructural clave de la médula ósea, FGF-2, un factor de crecimiento abundantemente sintetizado por el estroma de la médula ósea y fuertemente depositado en la matriz extracelular de la médula ósea ^31,32 y la i…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931