En<em> In Vitro</em> Dvala Modell av östrogen-känsliga bröstcancer i benmärgen: ett verktyg för molekylär mekanism Studier och Hypotes Generation

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

Bröstcancerceller metastasera till benmärgen innan sjukdomen är detekterbar ^1, så snart som små tumörer utvecklas blodkärl ^2,3. Den metastatiska processen är snabb men ineffektiv. Celler in i nya blodkärl snabbt på miljontals per dag ⁴ men få överlever resan till avlägsna organ ^5. Trots vissa mikrometastaser överleva i benet och kan hittas som enskilda celler eller små cellklumpar i benmärgsaspirat från nydiagnostiserade patienter ^1. Dessa celler motstå adjuvant kemoterapi, som administreras för själva syftet att eliminera dem ^6. Detta motstånd är utrustad, i huvudsak genom överlevnad signalering initieras av interaktioner med benmärgsmikro ^7,8. Mikrometastaser kan hittas i ungefär en tredjedel av kvinnor med lokaliserad bröstcancer och representerar en oberoende indikator på överlevnad vid analys av univariat analys ^9. Vissa micrometastases är tillväxt inletts, men återfall mönster beroende på celltyp. Patienter med trippel negativ bröstcancer tenderar att återkomma mellan 1 till 4 år, vilket tyder på dålig kontroll över vilande tillstånd. Andra celltyper, inklusive ER / PR + celler, kan förbli vilande i upp till 20 år, med en stadig, kontinuerlig andelen återfall ^10. Även skillnader i dvala genuttryck signaturer mellan ER + och ER bröstcellinjer och tumörer speglar olika dvala potentialer ^11, interaktioner med benmärgstroma utgör sannolikt ett betydande bidrag till dvala.

Studiet av dvala in vivo är exceptionellt svårt eftersom mikrometastaser är sällsynta och underlägsna av hematopoetiska celler med mer än 10 ^6-faldigt. Därför måste relevanta modeller skapas som ger in vitro-data som kan föreslå mekanismer och generera testbara hypoteser in vivo. Ett antal av dvala modeller, inklusive Mathe^17,18 och spontana tumör och metastasering modellerna ^19, har gett tiska modeller ^12,13, in vitro modeller ^7,8,14,15, in vivo xenograft-modeller ^16, kombinationer av in vitro och xenograft-modeller en inblick i cancercell dvala ²⁰ . Var och en av dessa modeller har sina egna begränsningar och är sig själva i första hand användas för att generera hypoteser om molekylär signalering och interaktioner som styr dvala som ska testas mer biologiskt relevanta modeller.

Med det övergripande målet att definiera de molekylära mekanismer dvala, samspelet med mikro som resulterar i cykelstopp, redifferentiering och terapeutiska motstånd och mekanismer som leder till återfall i ER + celler, vi utvecklat en in vitro-modell som ger utvalda relevanta delar av stromala mikromiljö ^7. Denna modell, medan relativt gles i komponenter, är tillräckligt robust för att tillåta forskare att ta fram särskilda molekylära mekanismer som påverkar väsentliga funktioner dvala. Dessa experiment generera hypoteser som direkt kan testas in vivo. Modellen bygger på några viktiga faktorer som vi visat sig vara relevant i dvala. De inkluderar användningen av östrogenberoende bröstcancerceller, odling av cellerna vid en klonogen densitet där deras interaktion är i första hand med underlaget och lösliga komponenter i mediet, en fibronektin substrat och närvaron av basisk fibroblasttillväxtfaktor (FGF-2) i mediet.

Vi kännetecknas mekanismer som styr systemet in vitro, inklusive induktionen av cellcykelstopp av FGF-2 ^21, förmedlas genom TGFp ^22, överlevnad signalering genom PI3-kinas ^7,8 och ERK ⁸ och morfogena differentiering till en epitelial fenotyp, vilket berodde på RhoA inaktive, integrin45, 5β1 uppreglering och ligering av stromal fibronektin för överlevnad ^7,15 (Figur 1). De cell in vitro cykel effekter av FGF-2 på MCF-7-celler börjar vid koncentrationer åtminstone en log under 10 ng / ml ^21,23. Den logiska grunden var baserad på den tidsmässiga kontrollen av FGF-2 expressions reglerar bröst duktal morfogenes, cyklisk expansion och recession i ett antal däggdjurssystem ^24-27. Vi visade att FGF-2 inducerar differentiering, inklusive duktal morfogenes i 3D kultur ^28, och att FGF-2 uttryck i allmänhet förlorade med malign transformation av humana tumörer ^29. Uttrycket av FGR1 förblev intakt i bröst tillfrågade ²⁹ och MCF-7-celler karcinom fortsätter att uttrycka alla 4 FGF-receptorer ^30. Inom ramen av dvala, är FGF-2 som exporteras av och kraftigt avsatt på benmärgstroma ^31,32 där den fungerar i bevarandet av hematopoietiska stamceller ^33. Vi DEMonstrated att FGF-2 inducerar ett vilande tillstånd i ER + bröstcancerceller odlade på fibronektin substrat, också rikligt i märgen, där det inducerar morfogena differentiering ^7. I modellen, bröstcancerceller är tillväxt hämmas, inaktivera Rho A genom RhoGap GRAF, redifferentiate till en epitelial fenotyp och återuttryck integriner α5β1 lost med malign progression. De binder fibronektin genom integrin α5β1 och aktivera överlevnad signalerar att göra dem resistenta mot cytostatikabehandling ^7,8,15 (Figur 1). Hämning av Rho klass GTPaser har visats tidigare att framkalla en vilande fenotyp ^34.

Här kommer vi att beskriva de särskilda förfaranden som möjliggör utredare att fastställa modellen och undersöka specifika molekylära och cellulära mekanismer som styr dvala av ER + bröstcancerceller. I de experiment som presenteras här för att illustrera användningen av modellen, Riktade vi PI3K vägen (Figur 1B) med en AKT-hämmare och en PI3K-hämmare och alla medlemmar i Rho familjen (figur 1B) med en pan-Rho-hämmare och en Rho-kinas (ROCK) hämmare.

Protocol

1. klonogen analys Förbered en enda cellsuspensioner av östrogenberoende bröstcancercellinjer MCF-7 och T47D-celler med användning av de steg som beskrivs nedan Aspirera odlingsmedium (DMEM / 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum / glutamin och pen / strep) från en 10 cm vävnadsodlingsskål, som inte är mer än 50% sammanflytande med MCF-7 eller T-47D-celler. Skölj med PBS. Inkubera med trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA löstes i DMEM med hög glukoshalt vid 37 ° C under 1-4 minuter. K…

Representative Results

Experiment utfördes för att rekapitulera analysen. Tidsförloppet för experimentet visas i figur 2A. Celler inkuberas vid klonogena densitet på dag -1, är FGF-2 i färskt medium tillsattes på dag 0 och celler odlas till dag 6 när de är färgade och kolonierna räknas. Eventuella störningar i systemet administreras på dag 3 i 100 pl volymer på 10x slutkoncentrationer önskas. Figur 2B visar det typiska utseendet av växande och vilande kolonier. Växande kolonier innehå…

Discussion

Vår modell består av flera viktiga delar av dvala i benmärgen. Den består av östrogenkänsliga celler, som är den typ som sannolikt kommer att förbli vilande i märgen under längre perioder ^10, den består av fibronektin, ett viktigt strukturelement i märgen, FGF-2, en tillväxtfaktor rikligt syntetiseras genom benmärgstroma och tungt deponerad i den extracellulära matrisen hos benmärgen ^31,32 och inkubering av celler vid klonogen densitet där deras interaktioner är i första hand med…

Materials

MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931