Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Blasenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen des Urogenitaltrakts, mit fast 75.000 neue Fälle jedes Jahr in den USA 1. Hohe Rezidiv erfordern lebenslanges Follow-up, die Blasenkrebs eine der teuersten Krebsarten behandelbar machen. Der Goldstandard für die Behandlung hochgradigen NMIBC ist transurethralen Resektion, gefolgt von intravesikale Immuntherapie mit BCG. Obwohl der genaue Mechanismus der Antitumoraktivität von BCG, muss noch vollständig aufgeklärt werden, wird akzeptiert, dass die Aktivierung der zellvermittelten Immunantwort der T-Helfer (Th) 1 und zytotoxische T (Tc) 1-Zellen angereichert ist für Der Erfolg der Therapie 2.
Trotz der Tatsache, dass BCG bleibt die Behandlung der Wahl für NMIBC ein hoher Anteil der Patienten nicht auf die Therapie zu antworten; Darüber hinaus kann sie eine Reihe von Nebenwirkungen haben: ca. 70% der behandelten Tumore nach einer gewissen Zeit wieder auftreten und ~ 15% Fortschritt auf die muskelinvasiven Form desKrankheit. Andere Nebenwirkungen, die mit BCG-Behandlung verbunden sind Dysurie, Zystitis und Nierenentzündung 3-6.
Die Entwicklung neuer Therapiestrategien zu beachten die Verwendung von präklinischen Modellen zu nehmen, nach der ersten in-vitro-Bewertung; Dies ist besonders wichtig bei Tumoren, deren Mikromilieu deutlich ihre Entwicklung und Ansprechbarkeit auf die Behandlung beeinflussen.
Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben verschiedene Aspekte der Immunmodulationsaktivität von HP-NAP, einer durch das Bakterium Helicobacter pylori hergestellte Protein gerichtet, zunächst als fördern kann endothelialen Adhäsion von polymorphkernigen Zellen (PMNs) 7 identifiziert. Strukturell gehört HP-NAP an die DNA-Schutz-Protein unter Bedingungen ausgehungert (DPS) Familie 8 und besteht aus 12 in einer dodecameren Schale angeordneten identischen Untereinheiten.
Wir haben gezeigt, dass HP-NAP isteinen Toll-like Rezeptor (TLR) 2-Agonisten mit einer starken immunmodulierende Aktivität zum Antreiben der Differenzierung von T-Lymphozyten verantwortlich Richtung des Th1-Phänotyp in vitro und in vivo 9-10. Im Rahmen dieser Tätigkeit ist HP-NAP in der Lage, die Th2-Immunantwort in die vorteil Th1-Antwort in einem Mausmodell von allergischem Asthma 11 umzuleiten.
Um die Th1-abhängige Anti-Tumor-Potenzial von HP-NAP bewerten, nutzten wir einem Mausmodell von Blasenkrebs durch O'Donnel und Kollegen 12 zur Bewertung der Auswirkungen der BCG Verwaltung vor einigen Jahren entwickelt.
Bei diesem Protokoll, zeigen wir, dass HP-NAP hat eine starke Antitumor-Potential gegen Blasenkrebs und dass die Wirksamkeit von HP-NAP Verabreichung Parallelen der signifikante Akkumulation im Tumor und regionale Lymphknoten, sowohl Th1- und Tc1 Lymphozyten produzieren Interferon ( IFN) -γ 13 </sup>. Tumore von HP-NAP behandelten Mäusen isoliert zeigte mehr Nekrose und weniger Vaskularisation als die unbehandelte Gegenstück.
Der vorliegende Bericht liefert eine stepbystep Protokoll Detaillierung der Vorbereitung der Tiere, deren Harnröhrenkatheter, der chemischen Verbrennung für die Befestigung der Zellen an die Blasenschleimhaut erforderlich ist und die Injektion der Tumorzellen. Wir beschreiben auch die topische Verabreichung von HP-NAP, die als Prototyp einer für die Behandlung von Blasenkrebs entwickelt therapeutische Wirkstoffe betrachtet werden kann. Die durch den Vergleich Tumoren von Steuerung und HP-NAP behandelten Tieren isoliert erlangten Beweismittel betont nicht nur die Tatsache, dass HP-NAP könnte ein guter Kandidat für Blasenkrebs Immuntherapie, sondern auch die allgemeine Wirksamkeit der Versuchsanordnung ist.
Der Großteil der Fortschritte in der Krebstherapie erfordern Tests in Tiermodellen, bevor klinische Studien. Die Möglichkeit, das Studium der Tumorbiologie in vivo, unter Ausnutzung der Tier-Modelle, ist ein entscheidender Werkzeug für Forscher untersuchen Krebs Pathogenese, so dass die Bewertung der unterschiedlichen Therapieansätze. Orthotopen Modellen bleibt der Goldstandard 14-15, sowohl wegen der riesigen Menge an Zelllinien, die Einrichtung eines Tumor-Modell, und weil sie die Umgebung des …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italienische Ministerium für Universität und Forschung, Projekte und Prin Progetti di Ricerca di Ateneo, gewähren N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo unterstützt wird, gewähren N ° 2011-0485 zu MdB, und durch Finanziamento Giovani Studiosi, Universität Padua, um Gaia Codolo.
Materials | |||
C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
Equipment | |||
Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System