효능 평가<em> H. 파이로리</em동소 이식 쥐 모델에서 방광암의 치료를위한 치료 도구로> 단백질 HP-NAP
Summary
Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Abstract
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Introduction
방광암 USA 1 거의 75,000 매년 새로운 사례로, 비뇨 생식 관의 가장 흔한 암이다. 재발의 높은 비율은 방광암 치료하는 비싼 암 중 하나를 만드는 평생 추적 관찰을 필요로한다. 고급 NMIBC의 황금 표준 치료는 BCG와 방광 면역 다음, 트랜스 요도 절제술이다. BCG의 항 종양 활성의 정확한 메카니즘은 완전히 밝혀지지 그대로지만, 그것은 T 헬퍼 (토륨) (1) 및 세포 독성 T (TC) 한 세포가 풍부한 세포 매개 면역 반응의 활성화에 중요한 것으로 받아 들여 이 요법의 성공.
BCG는 NMIBC위한 선택의 처리는 남아 있다는 사실에도 불구하고, 치료에 반응하지 않는 환자의 높은 비율; 또한, 부작용의 수를 일으킬 수있다 : 처리 된 종양의 약 70 %의 근육 침습적 형태 ~ 15 %의 진행을 일정 시간 후 재발 및질병. BCG 치료와 관련된 다른 부작용은 배뇨 장애, 방광염, 신장 감염 3-6을 포함한다.
신규 한 치료 전략의 개발은 초기 시험 관내 평가 다음, 고려 전임상 모델을 사용한다; 이것은 누구의 미세 크게 치료에 자신의 개발 및 응답에 영향을 미칠 수있는 종양에 특히 관련이있다.
지난 10 년간, 우리는 HP-NAP, 헬리코박터 파일로리 균에 의해 생성 된 단백질의 면역 변조 활동의 여러 측면을 언급 한 초기 다형 핵 세포 (백혈구) (7)의 내피 부착을 촉진 할 수있는 것으로 확인. 구조적으로, HP-NAP는 공복 상태 (DPS) 가족 (8)에서 DNA를 보호하는 단백질에 속하고 dodecameric 쉘에 배치 (12)와 동일한 서브 유닛으로 구성되어 있습니다.
우리는 HP-NAP가 있음을 증명하고있다T의 분화를 구동 할 책임 강력한 면역 조절 활성을 갖는 수신자 같은 수용체 (TLR) 2 효능 제는 시험 관내 및 생체 내 9-10 모두에서, 한 Th1 표현형으로 림프구. 이 활동의 미덕에서, HP-NAP는 알레르기 성 천식 (11)의 쥐 모델에서 더 유리한받은 Th1 반응에 TH2 면역 반응을 리디렉션 할 수 있습니다.
HP-NAP의받은 Th1 종속 항 종양 가능성을 평가하기 위해 BCG 투여의 영향을 평가하기위한 O'Donnel 동료 (12)에 의해 수년 전에 개발 방광암의 마우스 모델을 이용했다.
이 프로토콜로, 우리는 HP-NAP는 방광암에 대한 강력한 항 종양 가능성을 가지고 및 HP-NAP 관리의 효능 (인터페론을 생산 모두받은 Th1과에 T 림프구의 종양 및 지역 림프절 내에서 상당한 축적을 평행을 입증 IFN)은 13 -γ </> SUP. HP-NAP-처리 된 마우스로부터 분리 된 종양을 더 괴사 미처리 대조 미만 혈관 신생을 나타내었다.
본 보고서는 동물의 준비, 그들의 요도 카테터, 방광 점막 세포의 부착을 위해 필요한 화학적 연소 및 종양 세포의 주입을 자세하게, stepbystep으로 프로토콜을 제공한다. 또한 방광암의 치료를 위해 개발 된 임의의 치료제의 원형으로 간주 할 수있는 HP-NAP의 국소 투여를 기술한다. 제어 및 HP-NAP 처리 된 동물로부터 분리 된 종양을 비교하여 얻은 증거는 단지 HP-NAP 방광 암 면역 요법을위한 좋은 후보뿐만 아니라 셋업 실험의 전반적인 효율성이 될 수 있다는 사실을 강조한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암 치료에서의 진보의 대부분은 임상 시험을 시작하기 전에 동물 모델에서 시험을 요구한다. 생체 내 종양 생물학을 연구 동물 모델을 활용 가능성이 다른 치료 적 접근 방식을 평가할 수있는 암 발병 조사 연구를위한 중요한 도구를 나타낸다. 동 소성 모델은 금본위 제 14 ~ 15을 유지, 모두 때문에 종양 모델을 설정하고 할 수 세포주의 거대한 양의가 자연적으로 발생하는 종양 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Associazione Italiana의 당 라 Ricerca 술 Cancro, 대학의 이탈리아어 연구부, 인쇄용 프로젝트와 PROGETTI 디 Ricerca 디 아테네 오, 부여 N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo에 의해 지원되었다, N은 MDB에 2011-0485을 ° 및 Finanziamento 지오반니에 의해 부여 가이아 Codolo에 Studiosi, 파도바 대학.
Materials
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System
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