Évaluation de l'efficacité de la<em> H. pylori</em> Protéines HP-NAP comme outil thérapeutique pour le traitement du cancer de la vessie dans un modèle murin orthotopique
Summary
Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Abstract
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Introduction
Cancer de la vessie est l'un des cancers les plus fréquents de l'appareil génito-urinaire, avec près de 75 000 nouveaux cas chaque année aux Etats-Unis 1. Les taux élevés de récidive nécessitent tout au long du suivi, ce qui rend le cancer de la vessie l'un des cancers les plus coûteuses à traiter. Le traitement de référence pour la haute qualité CVSEM est la résection trans-urétrale, suivie par immunothérapie intravésicale avec le BCG. Bien que le mécanisme précis de l'activité anti-tumorale de BCG doit encore être élucidé, il est admis que l'activation d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire enrichie en lymphocytes T auxiliaires (Th) et une T cytotoxiques (Tc) une des cellules est essentiel pour la réussite de la thérapie 2.
Malgré le fait que le BCG reste le traitement de choix pour CVSEM, une forte proportion de patients ne répondent pas à la thérapie; En outre, il peut causer un certain nombre d'effets secondaires: environ 70% des tumeurs traitées réapparaissent après un certain temps et ~ 15% progrès à la forme du muscle-invasivemaladie. D'autres effets secondaires associés au traitement par le BCG comprennent dysurie, cystite et une infection des reins 3-6.
Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques doit prendre en considération l'utilisation de modèles précliniques, après évaluation initiale in vitro; ceci est particulièrement pertinent dans les tumeurs dont microenvironnement peut influencer de manière significative leur développement et leur réponse au traitement.
Au cours de la dernière décennie, nous avons abordé plusieurs aspects de l'activité de modulation immunitaire de HP-NAP, une protéine produite par la bactérie Helicobacter pylori, initialement identifiée comme capable de favoriser l'adhésion endothéliale de polynucléaires (PMN) 7. Structurellement, HP-NAP appartient à la protéine d'ADN-protecteur dans des conditions affamés (DPS) de la famille 8 et se compose de 12 sous-unités identiques disposées dans une enveloppe dodecameric.
Nous avons démontré que HP-NAP estun récepteur de type Toll (TLR) 2 agoniste, avec une activité immuno-modulation fort responsable de la conduite de la différenciation des lymphocytes T vers le phénotype Th1, à la fois in vitro et in vivo 10/09. En vertu de cette activité, HP-NAP est capable de rediriger la réponse immunitaire Th2 en réponse Th1 la plus bénéfique dans un modèle murin d'asthme allergique 11.
Pour évaluer le potentiel anti-tumoral Th1 dépendante de HP-NAP, nous avons profité d'un modèle murin de cancer de la vessie développé il ya plusieurs années par O'Donnel et ses collègues 12 pour évaluer l'impact de l'administration du BCG.
Avec ce protocole, nous démontrons que HP-NAP a un potentiel anti-tumoral puissant contre le cancer de la vessie et que l'efficacité de l'administration HP-NAP est parallèle à l'accumulation importante, dans les noeuds de la tumeur et les ganglions lymphatiques régionaux, à la fois des lymphocytes de type Th1 et Tc1 produire de l'interféron ( IFN) -γ 13 </sup>. Les tumeurs isolées de souris HP-NAP-traités ont montré une nécrose plus et moins vascularisation de la contrepartie non traitée.
Le présent rapport fournit un protocole de stepbystep, détaillant la préparation des animaux, leur cathétérisme urétral, la combustion chimique nécessaire pour la fixation des cellules de la muqueuse de la vessie, et l'injection de cellules tumorales. Nous décrivons également l'administration topique de HP-NAP qui peut être considéré comme un prototype de tous les agents thérapeutiques développées pour le traitement du cancer de la vessie. Les preuves obtenues en comparant les tumeurs isolées de contrôle et HP-NAP-animaux traités souligne non seulement le fait que HP-NAP pourrait être un bon candidat pour l'immunothérapie du cancer de la vessie, mais aussi l'efficacité générale de l'installation expérimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La majorité des avancées dans le traitement du cancer nécessitent des essais sur des modèles animaux avant de commencer les essais cliniques. La possibilité d'étudier la biologie des tumeurs in vivo, profitant de modèles animaux, représente un outil essentiel pour les chercheurs de l'enquête pathogenèse du cancer, permettant l'évaluation des différentes approches thérapeutiques. Orthotopiques modèles restent l'étalon-or 14-15, à la fois en raison de l'énorme quant…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, Ministère italien de l'université et de la recherche, les projets et Prin Progetti di Ricerca di Ateneo, accorder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, accorder N ° 2011-0485 à MdB, et par Finanziamento Giovani Studiosi, Université de Padoue, à Gaia Codolo.
Materials
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System
References
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