Abstract
말의 힘줄 및 인대 손상의 치료를위한 골수 중간 엽 줄기 세포 (BMMSC)의 응용 프로그램에서 최근 진보는 실험과 임상 연구 모두에서 결과 측정을 개선하는 것이 좋습니다. BMMSC는 많은 수의 건 병변에 주입되어 있지만 (일반적으로 10-20000000 세포) 만 상대적으로 적은 수의 생존 (<10 %)이가 이식 후 최대 5 개월 동안 지속될 수 있지만. 이 BMMSC 다른 조직으로 이식 된 다른 종의 일반적인 관측이 나타납니다이 손실이 많은 초기 주입 공정에서 살아남을 방법과 세포가 다른 장기로 삭제 여부, 발생했을 때 그것을 이해하는 것이 중요합니다. 세포의 운명을 추적하는 셀 위치 및 세포 수를 정량화의 생체 촬상의 비 침습적으로 허용 주입 BMMSC 전에 방사성 표지에 의해 달성 될 수있다.
이 프로토콜은 셀을 설명 labeli말의 부상 굴근 힘줄에 테크네튬 (TC-99m), 및 주입 다음이 세포의 추적을 사용 NG 절차. TC-99m 감마선을 방출 및 친 유성 화합물 hexamethylpropyleneamine 옥심 (HMPAO)의 존재 하에서 세포에 의해 내재화 될 수 단명 (t 1/2 6.01의 HR) 동위 원소이다. 이러한 속성은 여러 가지 질병의 진단을위한 핵 의학 클리닉에서 사용하기에 이상적이다. 표지 된 세포의 운명은 폐, 갑상선 및 다른 장기에 병변 세포의 분포에 보유 세포의 수를 모두 정량화 감마 신티 의한 단기 (36 시간까지)에 따라 될 수있다. 이 기술은 혈액 백혈구 라벨링 각색 및 다른 장기에 이식 BMMSC 이미지에 이용 될 수있다.
Introduction
병에 걸린 또는 손상된 조직의 복구를위한 재생 전략은 영향을받는 영역으로의 다양한 조직으로부터 유도 된 다 능성 및 주입 된 줄기 세포를 기반으로한다. 말의 힘줄 및 인대 손상의 치료를위한자가 BMMSC의 응용 프로그램에서 최근 진보는 모두 실험 1-5에서 개선 된 결과 측정 및 임상 연구 (6)을 보여 주었다. 말은 나이 앓고 및 원위 앞다리의 힘줄에 관련 부상 과도한 긴장, 그것은 운동 동물 때문에 치료 관련 줄기 세포의 효능을 평가하는데 특히 매력적인 모델이며,이 큰 용이 골수 회복이며 정확한 주입. 힘줄 손상은 섬유화와 함께 자연스럽게 치유하지만 치유 건 7 기능적으로 열등하고 다시 부상 (8)의 위험이 있습니다. 이 탄성 에너지의 역할을하도록 진화로 표면 디지털 굴근 건 (SDFT)는 가장 일반적으로 영향을받는상점과 경험을 높은 부하는 에너지 효율과 고속 운동을 달성하기 위해 강조하고있다. 손상 후 기능을 복원 때문에 중요하다. 이 부상은 유사한 기능 (9)을 수행 인간의 아킬레스 건에 영향을 미치는 것과 유사하다. 따라서 세포 기반 재생 전략이 성과를 향상시키고 재 부상을 줄이기 위해 매력적인 기회를 제공, 치료 또는 부상에 대한 좋은 보수를 달성하기 위해 더 좋은 치료 옵션이 없습니다.
대부분의 연구에서 5-20000000자가 BMMSC 보통 따라서 세포 수용기로서 작용 건 본체의 코어 내에서 발생하는 병변에 직접 주입된다. 일단 주입 된 세포의 운명은 세포가 최근 기술되었다 추적 명확하고 다른 세포 표지 방법이 아니다. 형광 태그로 표시된 셀은 상대적으로 적은 수의 (<10 %) 10, 11에서 생존 것으로 나타났다. 형광 라벨이 필요로시간을 소비하고하지 않는 조직 학적 분석을위한 조직 추출 및 단면은 쉽게 큰 동물 모델에서 임상의 경우 시간적 분석을 용이하게한다. 최근 연구에서 우리는 세포 레이블 및 감마 신티그라피 (1)에 의해 자신의 운명을 따라 방사성 동위 원소 99m Tc를 사용했다. 이 방법은 빠른 비교는 12 동맥 또는 정맥 주사를 통한 1,12- 경정맥 1 지역을 통해 정맥 내 관류 병변을 포함한 세포의 다른 전달 경로 사이에서 이루어질 수있다. 세포의 지속성과 분포는 다음 여러 장기의 감마 신티그라피에 의해 촬영 할 수 있습니다. 이것은 세포의 24 %가 24 시간 intralesionally (1)에 의해 병변에 남아 주입이 실험적으로 생성하여 병변과 같은 방사성 표지 (5)를 사용하여 다른 연구에 의해지지되는 것을 보여 주었다. 또한, 세포는 delivere 힘줄 병변으로 가정 제한 능력을 보여정맥 지역 관류 또는 의해 거라고하지만 후자의 노선 (4)에 의해 폐에 분산되어있다.
철 나노 입자로 표지 BMMSC는 앞다리 힘줄 (13)에 이식 된 세포를 추적 할 수있는 또 다른 방법이다. 철 나노 입자 표지 된 세포는 MRI에 의해 생체 내에서 세포의 추적을 허용하지만, 많은 동물 연구는 시간적 마취 MRI 스캔을 수행하기위한 각각의 시점에서 투여 할 수있는 횟수가 제한된다. 또한, 철 나노 입자는 건 본체로 표지화 된 세포의 이동에 대한 정보를 제한 MRI에 hypointense이다. 사용될 수있는 다른 방사성 동위 원소는 인듐-111을 포함하지만 이것 테크네튬 99m보다 더 긴 반감기의 불이익 (VS 2.8 일 6.0 시간) 및 높은 감마선 방사 에너지를 겪고있다. 인듐 - 111 (14)으로 표시 할 때뿐만 아니라, 세포 생존율이 감소 될 것으로보고되었다. TC-99m, 다른 한편으로는, 일상적으로 말 두 인간 핵에 사용약은 말초 혈액 단핵 세포를 라벨 및 신티그라피에 의해 생체 내에서의 분포를 따르십시오. 이것은 비교적 용이 세포, 테크네튬 99m-HMPAO 같은 테크네튬 바인딩 링커 분자로서 HMPAO을 이용하여 상기 셀에 의해 흡수 될 수있다. TC-99m-HMPAO는 BMMSC 좋은 가능성을 보여주고 체외 4에서 증식 할 수 표시. 이 프로토콜은 앞다리의 SDFT에서 자연적으로 발생하는 병변에 주입 라벨과 말자가 BMMSC의 추적을 자세히 설명합니다.
이것은 프로토콜 만 의도 연구 도구로서 이용 될 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 임상 치료 양상으로 그것의 사용은 완전히 해명되지 않은 세포 표현형에 방사성 표지의 효과하지 않는 것이 좋습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 경우는 실과 드 Veterinarios 드 말라가, 스페인의 동물 윤리 복지위원회, 왕립 수의과 대학, 노스 Mymms, 영국 말에 사용 된 절차에 의해 부여 윤리 허가 다음을 수행 하였다는 승인 된 프로토콜을 기반으로합니다 이식 후 진정 작용, 골수 흡인, 내 건의 주입, 지역 관류, 정맥 주사, 시술 후 치료 및 통증 관리 및 모니터링을 포함 줄기 세포 기반 치료를받는 말에 병원에서 사용.
1. 키 배열은 사전에 수
- 기관 윤리 및 동물 복지의 승인을 받아야하고 작업을 시작하기 전에 지역의 법적 요구 사항을 준수.
- 인력의 적절한 수준의 보호와 환경과 CONTAM의 처분을 포함하여 지역 및 법률 규정에 의해 결정으로 이온화 방사선 작업 할 제도적 승인을 받아야inated 폐기물.
- 다음과 같은 포함 기준을 사용 앞다리와 건 내 결함 및 결함의 결과로 병변의 표면 굴곡 디지털 건에 비 외상성 과도한 긴장 부상 (건 병증 또는 desmopathy)와 현재 말하는 것은 그대로 힘줄 및 / 또는 paratenon에 둘러싸여 .
참고 : 이러한 부상과 세포 주입 말의 임상 준비를위한 검사 및 진단은 다른 곳에서 -6,15- 자세한되었습니다.
참고 : 말의 골수에서 유래 BMMSC의 문화의 분리 및 확장 이전 -6,16- 자세히 설명하고있다. 말에 SDFT 부상에 대한 BMMSC를 주입하기위한 현재의 프로토콜은자가 골수 상층 액 (BMS) 16 ml의 4 당 천만 세포를 사용합니다. - 높은 통로 번호 C와 관련된 잠재적 인 세포 표현형 또는 유전 적 변형을 방지하기 위해 생체 내 이식에 대한 더 이상의 4 구절을 시행하지 않은 세포를 사용하여ELL 학생.
- BMS의 셀을 제공 할 필요 매수 (도 4에서 냉각 상자의 24 시간 이내 - O 8의 C) 세포 주입이 수행 될 수 의학적 클리닉.
주 : 골수 상등액 간엽 줄기 세포를 임상 적으로 사용이 허가를 요구할 수있다 ReCellerate INC (미국) 및 그것의 사용에 의해 소유 특허 절차이다.
참고 : Tc를-99m는 비교적 짧은 반감기를 가진 감마 이미 터 (140 keV의)이다 (6.0058 시간, 따라서 그것의 거의 94 %가 24 시간에서 99 Tc를의 안정적인 형태로 붕괴). 감마 에너지는 말과 동물 취급 담당자 모두 매우 제한된 방사선 노출 시간에 감마 카메라 (신티) 및 짧은 반감기에 의한 검출 결과에 적합한다. 이 프로토콜은 [HMPAO (소디움 퍼 테크네 테이트 등) Tc를-99m로 표지] 테크네튬 99m-HMPAO를 사용하여 세포의 현장 라벨링을 설명한다. - 이 세포 재치를 라벨에 대한 전달 및 사용되도록 공급 업체 신선한위원회-99m 주문는 TC-99m 발생기로부터 용출의 2 시간을 힌. 는 TC-99m는 1 ml의 용액 (공급 업체의 표준 버퍼)에 1 GBq로 제공되어 있는지 확인합니다.
- 실온에서 모든 버퍼를 사용합니다. 라벨 절차를 수행, 알코올로 세척 모든 장비와 동위 원소 봉쇄 방에있는 세포와 영상 (감마 신티)의 주입은 이전 작업의 시작 정리합니다.
앞다리 힘줄의 말과 초음파 2. 준비
- 시점에서 다음 제 (골수 흡인) 부상의 입학 및 기록 초음파 검사는 방사성 표지 된 세포를 주입하는 경우.
- 말은 마구간에 균등하게 무게를 베어링으로하고 (오히려 전신 마취보다) 진정 작용을 서에서 초음파 검사 및 세포 이식을 수행합니다. 0.01-0.02 ㎎ / ㎏의 IV에 detomidine HCl 및 타르타르산 부토 르파 놀의 혼합물을 사용하여 각각의 진정 작용을 관리.
참고 : 복구가 신속하고 수술이며 치료가 더 필요합니다특별한 고려 사항. - 신경초 마취가 영향을받는 사지에서 (단계 2.6)를 적용하면 치료 기간 동안 말의 움직임을 줄이기 위해 진정에 따라 역에서 말을 유지. 시각적으로 인하 머리 위치와 말의 태도에서와 말 세포 주입 및 신티 이미지의 취득시 감마 카메라의 움직임 동안 편안하다고 판단 진정 작용의 적절한 수준을 확인합니다.
참고 :이 때문에 진정 깜박임에서 눈 (건조를 방지하기 위해)에 수의사 연고를 적용 할 영향을받지 않습니다 필요하지 않으며 말은 눈의 수분을 유지 할 수 있습니다. 세포 주입 후 모니터링은 비 침습적 (초음파 감마 신티)이다. - 클립은 밀접하게 (말 머리 가위와) 힘줄 위에 놓인 머리는 결국 알코올 클로르헥시딘 수술 스크럽의 조합을 사용하여 클리핑 영역을 청소합니다.
- 지역에 음향 커플 링 젤을 적용하고직렬 온 입사 종횡 이미지를 획득하기 위해 선형 변환기 (12 MHz 또는 이와 유사한 것)과, (7) (17) - 완전한 손바닥 장골 영역의 스캔 순차적 표시된 레벨 1을 기록 조직적 스캔. 단면적과 최대 부상 영역 (4)이 화상 해석 소프트웨어의 도움으로 얻어 질 수 있도록 디지털 이미지를 저장한다.
- 건과 표면 디지털 굴근 건을 덮는 피부의 완전한 탈감작을 보장하기 위해 국소 마취제의 무균 주입을위한 손목에 즉시 말초 신경 손바닥 위에 놓인 영역을 준비합니다. mepivicaine 2 ㎖을 피하로하고 (그 서브 근막 위치) 손바닥 신경에 인접 굴근 힘줄 사이에 다리의 양쪽에서 손목 바로 원위 현수 인대 모두를 주입.
- 예비 스캔 클로르헥시딘 외과 영역들로 세정하여 이식 장소 준비를 수행되면crub의 적어도 5 분 솔루션 그리고 마지막으로 알코올 흠뻑 젖은 거즈와. 무균 방식으로 이후의 모든 단계를 수행합니다.
말 중간 엽 줄기 세포의 3 Tc를-99m-표시
주 : 셀 라벨링 단계는 힘줄로 셀 라벨 표지 된 세포의 이식 사이 최소화 동위 원소 붕괴 등의 앞다리 초음파 동안 수행 될 수있다.
- 이 동위 원소의 흡수 방해로 세포에서 BMS를 제거합니다. 이를 위해서는, 냉각 상자 BMMSC의 바이알 (BMS 1 ㎖에 1000 만 세포)를 검색하고 RT에서 5 분 동안 350 XG에서의 microcentrifuge에서 세포 펠렛. 조심스럽게 세포 재 부유를 돕기 위해 튜브의 작은 방울 (≤0.1 ml)에두고, 18G 또는 (2 ML의 주사기에 부착) 19G 바늘 뜨는을 제거합니다. 멸균 microcentrifuge 관에 뜨는 (BMS)을 저장하고 나중에 다시 사용하기 위해 얼음에 보관하십시오.
- FL하여 상등액의 잔여 액적에서 세포를 재현 탁(오히려 소용돌이보다) 손가락으로 부드럽게 튜브를 icking하고 실온에서 랙에 튜브를 둡니다. 세포가 완전히 재현 탁하고 눈에 보이는 세포 덩어리가 없는지 확인합니다.
- 다음과 같이 Tc를-99m을 준비합니다. 테크네튬의 양도 1 ml를 1 ML의 주사기와 바늘을 사용 HMPAO의 유리 병에 퍼 테크네 테이트. 부드럽게 잘 혼합 납 차폐 뒤 5 분 동안 둡니다. 참고 : 세포 단계 2.1에서 회전하는 동안이 단계를 수행 할 수 있습니다.
- 세포 1 ML의 주사기와 바늘을 사용하여 Tc를-99m-HMPAO 혼합물을 모두 추가하고 부드럽게 섞는다. 납 차폐 뒤에 RT에서 30 분 동안 배양한다.
- 다음 단계는, 동위 원소 (낀)의 엄지 손가락의 오염이어서 다른 장비를 최소화하기 위해 마이크로 원심 튜브의 뚜껑을 여는 집게 (또는 티슈 종이)를 사용한다. 추가하거나 세척 버퍼를 제거하기 위해 2 ML의 주사기와 21 G 바늘을 사용합니다.
주 : 필드 동위체 모니터의 사용 및 장비의 표면의 오염을 모니터링하도록 권장된다. 뚜껑을 닫고 부드럽게 혼합 스핀 단계 3.1에서와 같이 세포를 펠렛, TC를-99m-HMPAO 세포 혼합물에 1 ml의 PBS를 추가합니다. - 조심스럽게 새로운 튜브 (W1으로 납 차폐 및 레이블 뒤에이 저장)에 PBS를 제거합니다. 신선한 PBS 1 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 튜브를 원심 분리기와 (W2로이와 라벨을 저장) 위와 같이 뜨는을 제거합니다.
- W1 및 W2 튜브 및 세포 펠렛에 카운트를 측정하여 라벨링의 효율을 계산한다. 잘 동위 원소 선량 교정 기기의 각 튜브를 배치하고 분 (CPM) 당 카운트로 방사능을 기록하여이 작업을 수행합니다. (세포의 CPM 같은 방사능)로서 라벨링 효율을 계산 / (방사능 세포 상등액 +) × 100.
- BMS는 3.1 단계에서 저장 한 추가 후 잔여 PBS로 철저하게 세포를 재현 탁하고. 세포 병변 내 주입에 대한 준비가되어 있습니다.
Tc를-99m-HMPAO 표지 세포의 4. 주입
- 병변 내 주입초음파지도하에 건에
- 천천히 바늘 맞춰 1.5 2 인치 (50mm) 멸균 드레이프에 덮여 초음파 변환기와 길이 방향으로 환부의 최대 부상 구역으로 20 G 바늘을 도입 니들의 길이가 수 있으므로 바늘 정확하게 병변의 중심에있는 경우 ultrasonographically 식별 할 팁.
- 2 mL의 주사기에 세포를 수집, 적절한 차폐를 사용하여 20 G 바늘을 사용하여 (루어 락은 외부 오염의 위험과 리드 실드 커버에 주사기를 최소화하기 위해). 유체를 분실하지 않도록주의 바늘을 폐기하십시오. 이제 니들 건에 미리 위치 상에 표시된 세포를 주사기를 연결합니다.
- 조직에 바늘 기관이 명확하게 볼 수 있도록 바늘에서 초음파 프로브를 놓습니다. 병변에 느리지 만 꾸준한 속도로 세포를 주입한다. 주입에 아무 저항이 없음을 확인합니다. 이 발생하는 경우조심스럽게 초음파 유도하에 바늘의 위치를 변경. 병변에 유체 방출이 hyperechogenic 기포를 포함 무반향 유체로 초음파 영상에서 볼 수 있는지 확인합니다.
- 바늘을 인출 즉시 분사 셀의 손실을 방지하고, 사지의 외부 표면에 걸쳐 동위 원소의 확산을 최소화하기 위해 바늘 구멍을 통해 압력을 배치했다. 즉시 autoadhesive 붕대의 한 층으로 사지를 드레스. 말은 지금 감마 신티에 대한 준비가되어 있습니다. 바로이 작업을 수행합니다.
주 : 힘줄로 세포를 주입 한 후, 주사기에 남아있을 수 직접적인 세포 손실을 평가하기 위해 빈 주사기 바늘의 개수를 획득.
- Tc를-99m-HMPAO 표지 세포의 지역 관류
- 2.4 단계를 따릅니다.
- 내측 및 측면에 위치 두 개의 100mm면 롤 거즈 붕대 근위 장부에 100mm 고무 지혈대 붕대를 적용합니다.
- 무균 일을 준비적어도 5 분 동안 수술 스크럽 클로르헥시딘 용액으로 세정하여 영역을 최종적으로 알코올에 적신 거즈 횡 근위 종자 골 뼈의 수준에 좌우 손바닥 정맥을 통해 디지털 전자 피부. 무균 방식으로 이후의 모든 단계를 수행합니다.
- 헤파린 멸균 식염수로 작성하여 정맥 천자에 대한 21 G의 X의 ¾ "(0.8 × 19mm) 나비 바늘 세트 100 mm 확장을 준비하고 측면 손바닥 디지털 정맥에 바늘을 소개합니다. 정맥가 입력되면 혈액이 부분적으로 확장 세트를 채울 것입니다. 루어 록 커넥터에 표시된 세포의 후속 주입을 용이하게하기위한 루어 잠금 고무 캡을 부착합니다.
- 사전로드 PBS 20 ㎖ 주사기로 세포를 수집하여 PBS 19 ㎖ 중의 엽 줄기 세포를 희석. (- 40 초 30) (18) G (1.2 X 40mm) 느리지 만 꾸준한 속도로 피하 주사 바늘을 사용하여 고무 컵을 통해 세포를 적용합니다. syring에 미리로드 PBS 1 ㎖로 카테터를 플러싱이자형.
- 다섯 4 × 4면 거즈 층으로 바늘 구멍을 통해 피부에 압력을 즉시 바늘을 제거하고. 그런 다음 근위 종자 골의 영역에 탄성 접착제 빛 붕대를 배치하고 주입 후 30 분 동안 자리에 지혈대를 둡니다.
- 30 분 후 지혈대를 놓습니다. 말은 지금 감마 신티에 대한 준비가되어 있습니다.
주 : 세포를 주입 한 후, 주사기에 남아있을 수 직접적인 세포 손실을 평가하기 위해 빈 주사기 바늘의 개수를 획득.
5. 감마 신티
- 신티 이미지
- 낮은 에너지, 평행 구멍 조준기를 장착 (20 % 대칭 창을 사용하여 140 KeV의 광전 피크로 설정) 감마 카메라와 평면 신티그라피 이미지를 획득.
- 단계 2.2에서와 같이 진정 말 서에 시간 0 후 모든 이미지를 얻습니다. 시간 0 scintigram 후, 주입시를 통해 빛 붕대를 교체패딩 붕대 테. 각 신티그라피 시험하기 전에이 붕대를 제거합니다.
- "연구 선택"- - "획득"로 처리 소프트웨어를 사용하여 60 초마다 (256 256 매트릭스)에 대한 정적 인 이미지를 획득 "뼈 정적"옵션을. 이는 정적 모드 옵션 움직임 보정 모듈을 가지고 있지 않기 때문에 말 화상 획득 기간 동안 움직이지 않는 것이 필수적이다.
- 병소 내 주사의 경우, 말단부에 손목에서 병변 영역으로부터 좌우 영상을 구 반대편 다리, 왼쪽 폐야 좌측 갑상선의 등가 영역. 앞다리 이미지 획득 동안 사지 반대측의 화상을 방지하기 위해 다리 사이 리드 화면 위치. 주입 (시간 0) 후의 5 분간의 영상을 획득 한 후 1, 3, 6, 12, 24, 36 및 48 시간에서.
- 지역 관류를 들어, 5.1.1.3에 관해서는 측면과 등의 감마 이미지를 얻을 수 있습니다. 이미지 5 분 AF를 얻습니다터 지혈대 자료. 이 즉시 방출 지혈대 이전에 수를 평가하기 위해 세포를 주입 후에는 사지 이미지에 유용 할 수 있습니다 시간이 0이됩니다. 세포의 투여 후 1, 3, 6, 12, 24, 36 및 48 시간에 감마 영상을 얻었다.
- 이미지가 인수 한 후, 프로세스를 수동으로 "Sokoloff"색상 "반전"색상 선택 옵션을 사용하여 소프트웨어의 "처리"옵션을 사용하여 이미지. 이 병변 영역에 걸쳐 선택 마스크와 운동의 재 형성을 허용하는 다음 "관심의 영역"(ROI) 및 "타원"를 선택합니다. "통계에 추가"옵션을 선택하여 투자 수익 (ROI)을 통해 수를 가져옵니다. 관심 (ROI)의 동일 크기의 영역을 서로 다른 시간 지점에서 각 동물에 대한 기록을 확인합니다.
- 이어서, 각 시점에서의 테크네튬의 붕괴에 대한 예측 카운트를 수정한다. 부패를 수정하기 위해 다음의 식을 사용하여= 전자 O를 - (0.693t는 / T 1/2) 붕괴가 시간 제로 방사능 수정 O는 동위 원소의 초기 활동, A는, T는 경과 시간이며, T 1/2 절반 동위 원소의 - 생활. 다음 식을 이용하여, 남은 세포의 비율을 해결하기 위해 시간 0에서 ROI의 백분율로서 각 시점에서의 보정 계수를 표현 :
- 낮은 에너지, 평행 구멍 조준기를 장착 (20 % 대칭 창을 사용하여 140 KeV의 광전 피크로 설정) 감마 카메라와 평면 신티그라피 이미지를 획득.
남은 세포 % (t) = 100 - {[(예측 붕괴 (t) - 감쇠 (t)가) / 감쇠 예측 (t)]을} × 100
부패 (T) = 투자 수익 (ROI) (t)는 / 투자 수익 (ROI) (0) × 100.
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Representative Results
BMMSs에 TC-99m-HMPAO의 통합에 악영향을 조직 배양 플라스틱을 준수 할 수있는 능력에 영향을주지 않습니다 그리고 그들은 (그림 1) 단일 층을 형성하는 확산 능력을 표시하는 동안 우리는 확산 속도 또는 다른 세포 표현형이 영향을 받는지 완전히 결정하지 않았습니다. 이들의 형태는 전형적인 스핀들 모양으로 레이블이 지정되지 않은 세포와 유사하다. 세포의 표지 효율 (즉. 라벨의 흡수는) 일반적으로 약 1.5 %에서 25 %로 다양하다. 낮은 라벨 효율의 주된 이유는 모-99 / TC-99m 발생기가 용출 된 사이트에서 병원에 99m Tc를의 전달 지연과 관련되었다. 이상의 2 시간의 지연은 세포의 라벨에 큰 감소가 발생할. 그러나 충분한 동위 원소는 최대 36 시간 (그림 2)에 대한 감마 신티그라피를 수행하기 위해 세포에 통합됩니다. 라벨의 효율성을 향상시킬 수있는 요인이 토론에 자세히 설명되어 있습니다.
1 또는 동맥 (12)를 통해 (직접 병변에) 또는 지역 관류에 의한 병변 내 주입 1 일까지. 부상 힘줄의 핵심이며 세포 수용기로서 작용 그대로 힘줄 조직에 의해 둘러싸인 경우 병변 내 주입이 가능하다. 지역 관류들은 혈관에 주입되지만 방법은 중간 엽 줄기 세포가 힘줄 병변 "집에서"할 수 있다는 기대에 의존으로 세포를보다 쉽게 관리 할 수있는 경로이다. 중간 엽 줄기 세포는하지만 특별히 집 건 병변의 사이트에 할 수있는이 방법은 중간 엽 줄기 세포의 유도 용량을 증가시킬 수 있습니다 응용 프로그램 개발을위한 유용한 실험적인 접근 방식을 제공하는 제한된 증거가있다.
병소 내 전달 경로로, 셀이 상대적 시간, 즉 국부적으로 유지 신호의 국소 영역으로 간주한다. 제한의 존재pread 또는 주변 힘줄 조직에 세포의 이동. 세포 디지털 손바닥 정맥 (도 2)를 통해 지역 관류에 의해 투여 될 때 반대로, 주사 부위 시간 신호의 점진적인 감소가있을 것이다. 폐 필드 부정적하지만 매우 이른 시점에서 어떤 경우 폐 개 (도 3)를 일반화된다 후 초점이 될 수있는 동위 원소 및 신호를 나타낼 수 것이 병소 내 주사와 공통이다. 갑상선이 투여 경로에 부정적인 남아있다. 지역 관류 마찬가지로 다음 더 확산된다하지만 신호가 관찰 병변 내 경로에 비해 훨씬 더 강렬 폐 초점 신호를 표시 할 수있다. 갑상선은 종종 초점 신호를 표시 할 수 있습니다.
세포 (시간 0, 미리 주입)과 관심 영역에서 초기 감마 scintigram에서 카운트의 초기 총 방사성 동위 원소의 수 (시간 0, 후 난njection)을 언급하고, 각 시점에서 카운트에서의 감소 백분율을 계산하는데 사용된다. 이것은 초기 카운트에서 Tc를-99m의 예측 붕괴 (그림 4)에 비교하는 데 사용됩니다. 계산 된 곡선은 예측 곡선을 따릅니다. 그러나 계정에 예측 붕괴를 복용 후, 병변 내 투여 후 주사 부위에 남아있는 세포의 지속성 (12 시간에서) 약 32 %와 (24 시간에서) 24 % (그림 4)입니다.
그림 1. 셀 라벨, 사출 및 감마 신티 리드 늘어선 차폐 (화면과 주사기 홀더) 및 방사선 모니터와 마이크로 원심 뒤에 Tc를-99m-HMPAO와 이전의 라벨에의 microfuge에 BMMSC의 (A) 전송.; (B) 조직 배양 접시에보기 좋은 m 시드 테크네튬 99m-HMPAO 표지화 된 세포의 분취orphology, 생존 및 증식; (C) 오른쪽 앞다리의 SDFT의 부상 부위에 초음파지도하에 Tc를-99m-HMPAO 표지 세포의 주입; (D) 앞다리의 감마 신티. 감마 카메라는 정확하게 기동성 유압 팔과 반대쪽 사지의 세포가 다리 사이에 개최 리드 방패에 의해 제거되어 표시 잠재적를 사용하여 위치한다. 감마 카메라 마찬가지로 폐 필드를 모니터링 할 수있는 가슴이나 갑상선 필드를 모니터링 할 수있는 목에 위치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. SDFT의 초음파 및 감마 횡선. (A의 중간 중수골 지역에서 앞다리의 전형적인 ultrasonographs (B)의 단면. SDFT의 병변은 명확하고 SDFT 아래에 인접한 깊은 디지털 굴근 건 (DDFT)의 손상되지 않은 (일반) 조직의 무결성에 비해 (스캔의 상단을 향해) 저 에코 영역으로 볼 수있다. 병변 및 힘줄의 상대 위치의 영역이 아래 개략적으로 도시된다. 감마 주사 검사는 디지털 손바닥 정맥을 통해 정맥 지역 관류에 의한 병변 또는 (D)에 주입 된 세포 (C)에 대해 표시되는 방사성 동위 원소 표지 된 세포의 3, 6, 12 시간 후 분사에서 수행. 도시 된 경우에, SDFT (실선 화살표)의 병변 부위에서 방사성 표지 된 세포의 흡수가 있었다. 손바닥 디지털 정맥에 의해 흡수의 지속성이 점선 화살표로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
초기 시점에서 그림 폐 및 갑상선 3. 감마 횡선. 일반적인 검사는 병변 내 주사 및 표지 세포의 지역 관류 모두 표시됩니다. 폐 및 갑상선 분야에 초점 및 확산 신호를합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
방사능의 그림 4. 부패는. 병변 내 주사 후 관심있는 지역에서 기록 된이 말에서, 카운트는 병변에 주입 한 후 36 시간 동안 SDFT의 감마 횡선에서 측정 하였다. 왼쪽 패널 : 각 시점에서의 방사능이 시간에 대해 0의 값을 산출 하였다. 그때99m Tc를의 방사능에 ATURAL 붕괴는 비교를 위해 표시됩니다. 오른쪽 패널 : 남아있는 세포의 추정 비율입니다. 이는 관심있는 지역의 방사능 수준에서 계산됩니다. 이 경우 24 시간에 세포의 잔존 율은 약 24 %였다. 우리는 21 마리에 (MSC와 주입의 라벨)이 프로토콜을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
골수 외에도, 이러한 지방 조직과 같은 소스로부터 격리 줄기 세포는이 프로토콜에 표시하기에 적합하다. 또한, 냉동 상태에서 세포 부활 및 라벨 연구 (12)에 대해 원하는 번호로 문화 확장 할 수있다.
BMMSC 레이블의 효율성을 결정하는 중요한 요소는 radiopharmacy에서 몰리브덴 발생기는 TC-99m의 용출 사이의 시간, Tc를-99m-HMPAO의 준비 및 병원에서 방사성 의약품의 사용이다. 이 기간 이후의 지연이 크게 표시 셀의 효율을 저해 할 수 있도록 테크네튬 발생기에서 용출 99m 표지 효율과 시간 사이의 반비례 관계가있다. 따라서, 가까운 조율은 실험실에서 세포의 전달 및 세포가 방사성 동위 원소 표지 및 이식 될 날에 병원에 TC를 - 99m의 전달 사이에 필요합니다. clini에 전송 시간따라서 C 중요한 요소이다. 공급 업체의 데이터 시트는 TC-99m의 붕괴 이후는 TC-99m와 촬영 Tc를-99m-HMPAO의 양을 HMPAO의 결합을 방해 할 수있는 2 시간 후 용출 후 방사 화학의 순도를 줄일 수 지정 세포에 의한 최대. 우리는 또한 실험실 환경에서 배양 된 세포의 라벨은 병원에서보다 더 효율적으로 라벨을 준 것을 지적했다. 이는 또한 세포를 실험실 환경에 표지 된 5 마리의 다른 연구에 의해보고되었다. 또한, 우리의 경험에서, 레이블은 문화로부터 제조 된 세포에 비해 혈액이나 조직 샘플에서 준비하는 즉시 표시되어 세포에 의해보다 효율적으로 흡수된다. 그러나, 라벨의 낮은 효율로 신티 36 시간 동안 수행하는 세포에 결합 충분한 라벨이있다.
40 %의 효율 라벨링 - 99m 테크네튬이 사용되는 경우에서 80 %가 백혈구에 대해 달성 될 수있다(- 0.5 mL의 1), 30 분 (18)와 작은 부피에서 수행 반응 내의 신선한 발생기 용출액. 47 %의 효율 라벨링 - 71 % 말은 MSC들 (19)은 이상적인 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 표지 효율을 증가시킬 수 있음을 입증 달성되었다.
최대 천만 세포가 큰 병변 주입되었지만 우리는 일상적 SDFT 코어 병변의 치료를위한 2 천만 세포 이식. 이 방법은 일반적으로 인해 더 복잡한 절차의 사용하지 않는 경우에도 세포의 비슷한 숫자는 지역 관류를 통해 이식 할 수있다. 그러나, 병변 세포에 충분한 집 기대 힘줄 표면의 주변으로 연장 병변에 유용 할 수있다. 감마 신티그라피에 의해 세포를 추적하는 것은 다른 경로로 투여 세포의 이동에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 병변 내 경로에 의해 주입 된 세포는 아르 mostlY는 병소 내 경로로 주사 부위에 유지. 방사성 동위 원소 신호는 경우에 따라서 폐 분야에서 관찰 될 수 있지만, 그것은 세포의 작은 이동 거리 병변 부위에서 떨어져 있음을 일반적으로 나타난다. 지역 관류하여 BMMSC 배달은 부상 부위에 세포의 보존이있을 수 있음을 시사하지만, 정맥 주사 (4)에 의해 전달 될 때 우리는 세포의 유도를 관찰하지 않았습니다. 테크네튬 99m-HMPAO는 세포에 의해 내재화 및 세포질 내에 보유 될 때위원회-99m-HMPAO 라벨, 세포 이주 능력 (20)에 영향을하지 않으며, 그것의 접착 성을 방해하지 않을 것이다.
이 (죽은 세포 또는 살아있는 세포에서 방출의 다른 메커니즘에서 방출) 세포에서 레이블의 중요한 해리가있을 수 있다는 가능성이로 관심의 영역에서 신호의 계산은 과소 평가 될 수있다. 갑상선은 무료 죽었거나 죽어가는 세포에서 방출 동위 원소 (TC-99m) 및 Tc를-9를 캡처9m-HMPAO는 신장과 직감에 의해 제거 될 수있다. 이 조직은 라벨의 잠재적 인 손실을 평가하기 위해 감마 신티그라피에 의해 모니터링 될 수있다.
셀 라벨 절차는 서로 다른 전송 경로를 사용하여 다양한 부위 (장기 부상)에서 셀 보유 및 흡수를 테스트하기 위해 적용될 수있다. 폐에 신호의 초점 성격은 아마도 시간과 함께 휴식 또는 세포 용해를 입력 세포 집합체를 표시 할 수있다. 죽은 세포로부터 세포를 주입하고, 이로부터 생성 된 파편들이 순환을 통해 갑상선에 더 접근 경로를 가지고 있기 때문에 자유 동위 원소를 포착 갑상선, 아마도 지역 관류 다음 흡수의 증가를 나타낸다. 세포의 약 24 %가 24 시간 후에 남아 있지만 대부분은 갑상선에 여유 99m 테크네튬 없었다 같이 건에 병소 내 경로가 가장 효율적인 경로를 제공한다. 이러한 프로토콜을 이용하여 얻은 정보는 미주리에 대한 줄기 세포 응용 프로그램의 미래를 설계 및 개발을 알릴 수효과적인 임상 치료 재.
셀 라벨 프로토콜은 인간의 의료 애플리케이션에서 백혈구의 Tc를-99m-HMPAO 라벨의 말에 사용하기 위해 적응했다. 이 프로토콜에서의 사용은 힘줄 질환은 세포 기반 치료의 조사를 위해 자발적으로 발생하는 대형 동물에 적용 가능성을 보여줍니다. 임상 케이스의 채용은 더 큰 동물 작업과 관련된 더 높은 비용을 상쇄하는 데 도움이 될 수 있습니다. 영상 기법으로 사용하기 위해 라벨링 절차는 작은 동물 모델 (21)에 기재 한 내용과 우리는 프로토콜 마찬가지로 그러한 다른 건 질환의 연구를위한 동물 큰 양으로 이용 될 수 있다고 믿는다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
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