組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います
Summary
Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.
Abstract
筋肉生検の組織学的評価は、神経筋疾患の病態の発症および進行の理解に不可欠なツールを務めています。しかし、そうするためには、適切なケアは、最適な染色を達成するための組織を切除し、保存するときに注意が必要です。組織保存する一つの方法は、ホルムアルデヒドで組織を固定し、その後パラフィンワックスでそれらを埋め込むことを含みます。この方法は、よく形態を保持し、室温で長期保存を可能にしますが、面倒であり、有害な化学物質の取り扱いが必要です。また、効果的な免疫染色のための抗原回復プロトコルを必要と抗原架橋、ホルムアルデヒド固定をもたらします。逆に、凍結切片は、固定を必要とし、したがって、生物学的な抗原の立体構造を保持しません。この方法は、intraoperaような迅速な組織学的評価を必要とする状況で、それは特に有用なもの、時間の周りクイックターンで明確な利点を提供します外科的生検を的。ここでは、異なる組織学的および免疫学的汚れによる可視化のための筋肉生検を調製する最も効果的な方法を説明します。
Introduction
筋肉組織学の検討は、神経筋障害1-4の異なるタイプの理解に重要な役割を果たしています。他の技術と組み合わせると、それは研究者が病状の症状および進行のより良いアイデアを得ることができ、また、治療的介入5-10の有効性を評価するために不可欠であることができます。しかし、正確に、組織を直ちに切除前の生理的状態を維持するように適切な方法で保存する必要があります。これは、除去、保存、切片、および染色の際に細心の注意が必要です。
組織を光学顕微鏡研究のため、2つの異なる方法で調製することができます。 （FFPE）のセクション、埋め込 まれた第1の方法、ホルマリン固定パラフィンは、組織はパラフィンワックス11,12に埋め込 まれる前に、10％の自然緩衝ホルムアルデヒド中に固定することが必要です。固定工程は、より良い形態を維持するのに役立つだけでなく、クロスリンク内因性のPRoteinsは、このように免疫染色のための複雑な抗原回復手順を必要とし、このようなセクション12の酵素染色の可能性を排除します。凍結切片を、一方、予め固定または処理する必要はありません。したがって、タンパク質は、天然の生物学的な立体配座13,14を保持することができます。また、凍結切片はまた、時間に肉腫および他の外科的生検15の術中診断で、たとえば、必要である、迅速なターンアラウンドタイムを可能にします。適切に行われていない場合は、この方法は、組織学的検査のためのセクションでは、不向き作る筋肉のアーキテクチャの変更を紹介しダメージを、凍結する傾向があります。本稿では、適切な検査のために最適な染色を達成するために、筋肉生検を準備するための最も効果的な方法を概説します。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織学および免疫組織化学は、様々な神経筋障害で病状の症状および進行を理解する上で重要なツールとして使用されています。古典的には、筋肉生検は、最初のホルムアルデヒドで固定し、その後パラフィンワックスで包埋しました。ホルムアルデヒド固定は、組織構造を保持し、室温で組織保存および輸送を可能にするが、それはまた、正確な免疫染色を達成するためのさらなるス?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).
Materials
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029 |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as ‘gold standard’ for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
