Qué hacer y qué no hacer en la preparación de Muscle criosecciones de Análisis histológico

Summary

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Abstract

La evaluación histológica de las biopsias musculares ha servido como una herramienta indispensable en la comprensión del desarrollo y la progresión de la patología de los trastornos neuromusculares. Sin embargo, con el fin de hacerlo, el cuidado apropiado debe ser tomado cuando la escisión y la preservación de los tejidos para lograr tinción óptimo. Uno de los métodos de conservación de tejidos implica la fijación de tejidos en formaldehído y luego incrustarlos con cera de parafina. Este método preserva la morfología bien y permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente pero es engorroso y requiere la manipulación de productos químicos tóxicos. Además, los resultados de fijación en formol antígeno entrecruzamiento, lo que requiere protocolos de recuperación de antígeno por inmunotinción eficaz. Por el contrario, seccionado congelado no requiere la fijación y por lo tanto retiene conformación antígeno biológica. Este método también proporciona una clara ventaja en vuelta rápida alrededor del tiempo, por lo que es especialmente útil en situaciones que requieren evaluación histológica rápida como intraoperaTIVE biopsias quirúrgicas. A continuación se describe el método más eficaz de preparar biopsias musculares para la visualización con diferentes tinciones histológicas e inmunológicas.

Introduction

El examen de histología muscular juega un papel crítico en la comprensión de los diferentes tipos de trastornos neuromusculares ^1-4. Cuando se combina con otras técnicas, permite a los investigadores para obtener una mejor idea de la manifestación y la progresión de la patología y también pueden ser esenciales para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica ^5-10. Sin embargo, para ser precisos, los tejidos necesitan ser conservado en la manera apropiada a fin de preservar el estado fisiológico inmediatamente antes de la escisión. Esto requiere gran cuidado durante la extracción, preservación, seccionamiento y tinción.

Los tejidos pueden prepararse de dos maneras diferentes para estudio microscópico de luz. El primer método, formol fija en parafina (FFPE) secciones, requiere tejidos que se fijaron en formaldehído al 10% tamponada naturales antes de ser integrado con cera de parafina ^11,12. La etapa de fijación ayuda a preservar la morfología mejor, pero también vínculos transversales pr endógenaoteins necesitando por lo tanto los procedimientos de recuperación de antígeno intrincada de inmunotinción y eliminando la posibilidad de tinción enzimática en tales secciones ^12. Las secciones congeladas, por otra parte, no tienen que ser pre-fijo o procesados; por lo tanto, las proteínas son capaces de retener conformaciones biológicos nativos ^13,14. Además, las secciones congeladas también permiten el tiempo de respuesta rápida, que a veces es necesario, por ejemplo en el diagnóstico intraoperatorio de los sarcomas y otros biopsias quirúrgicas ^15. Sin embargo, si no se hace correctamente, este método es propenso a los daños por congelación, que introduce cambios en la arquitectura muscular haciendo las secciones no aptos para el examen histológico. En este trabajo se expondrá el método más eficaz para preparar las biopsias musculares para lograr tinción óptimo para examen adecuado.

Protocol

1. Tejido Cosecha y congelación de los tejidos musculares La eutanasia del ratón con una sobredosis de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Realice este paso en una campana de extracción y el uso de un método de contención secundaria, como un secador o una campana de vidrio que contiene un hisopo de algodón empapado en isoflurano. Confirmar la muerte apretando firmemente la almohadilla plantar. Use un método secundario de la eutanasia como la dislocación cervical….

Representative Results

La puesta a punto para la cosecha y la congelación de los tejidos se puede ver en la Figura 1. Tejidos extirpados se deben almacenar en una gasa empapada en PBS para evitar el secado (Figura 1A). Cuando se seleccionan los tejidos a ser utilizado para el análisis histológico deben ser sumergidos en OCT y se presentarán en molde crio en la orientación adecuada y lo más cerca a la longitud fisiológica como sea posible para asegurar la morfología exacta (Figura 1B)….

Discussion

Histología e inmunohistoquímica se han utilizado como herramientas clave en la comprensión de la manifestación y la progresión de la patología en diversos trastornos neuromusculares. Clásicamente, las biopsias musculares se fijaron por primera vez en formaldehído y luego incrustados con cera de parafina. Si bien la fijación de formaldehído conserva la arquitectura del tejido y permite el almacenamiento y transporte del tejido a temperatura ambiente, también inactiva las enzimas y los entrecruzamientos proteí…

Materials

Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029
OCT	4583	Sakura Inc.	Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific