Do's en Don'ts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse
Summary
Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.
Abstract
Histologische evaluatie van de spier biopsieën heeft gediend als een onmisbaar hulpmiddel in het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van de pathologie van neuromusculaire aandoeningen. Echter, om dit te doen, de juiste zorg moet worden genomen bij het uitsnijden en conservering weefsels optimale kleuring bereiken. Een methode van weefsel behoud impliceert vaststelling van weefsels in formaldehyde en vervolgens inbedding ze met paraffine. Deze werkwijze behoudt morfologie goed en zorgt voor langdurige opslag bij kamertemperatuur, maar is omslachtig en vereist behandeling van toxische stoffen. Verder formaldehyde fixatie leidt antigeen cross-linking die antigen retrieval protocollen noodzakelijk voor een effectieve immunokleuring. Integendeel, ofwel bevroren coupes geen fixatie nodig en behoudt dus biologische antigen conformatie. Deze methode biedt ook een duidelijk voordeel in snelle draai rond tijd, waardoor het vooral handig in situaties nodig snel histologische evaluatie zoals intraoperatief chirurgische biopten. Hier beschrijven we de meest effectieve methode voor het bereiden spierbiopsieën visualisatie met verschillende histologische en immunologische vlekken.
Introduction
Onderzoek van de spieren histologie speelt een cruciale rol in het begrijpen van verschillende soorten neuromusculaire aandoeningen 1-4. In combinatie met andere technieken, laat onderzoekers een beter beeld van de openbaring en de progressie van de pathologie krijgen en kunnen ook van essentieel belang voor de efficiëntie van een therapeutische interventie 10/05 evalueren. Echter, om nauwkeurig te zijn, moet het weefsel op de juiste wijze worden bewaard om de fysiologische toestand onmiddellijk voor excisie behouden. Dit vereist grote zorg tijdens het verwijderen, behoud, snijden, en vlekken.
Weefsels kunnen worden bereid op twee verschillende manieren voor lichtmicroscopische studie. De eerste methode, formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) secties, vereist weefsels in 10% natuurlijk gebufferd formaldehyde vast te stellen voordat ze worden ingebed met paraffine 11,12. De fixatie stap helpt om de morfologie beter, maar ook kruisverbindingen endogene pr behoudenoteins dus noodzakelijk ingewikkelde antigen retrieval procedures voor immunokleuring en het elimineren van de mogelijkheid van enzymatische vlekken op dergelijke secties 12. Vriescoupes, anderzijds, hoeven niet vooraf vastgesteld of verwerkt; Daarom, eiwitten zijn in staat om inheemse biologische conformaties 13,14 behouden. Verder vriescoupes stelt snel doorlooptijd, die soms noodzakelijk is, bijvoorbeeld in de intra-operatieve diagnose van sarcomen en andere chirurgische biopten 15. Indien niet goed uitgevoerd, deze methode is gevoelig voor beschadiging, die wijzigingen van de spierarchitectuur waardoor de secties geschikt zijn voor histologisch onderzoek introduceert bevriezen. Dit document zal de meest effectieve methode om spieren biopten te bereiden met het oog op een optimale kleuring voor de juiste examen te bereiken schetsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histologie en immunohistochemie werden gebruikt als essentiële hulpmiddelen voor het begrijpen van de openbaring en de progressie van de pathologie in verschillende neuromusculaire aandoeningen. Klassiek, werden spierbiopten eerst vastgesteld in formaldehyde en vervolgens ingebed met paraffine. Terwijl formaldehyde fixatie behoudt weefsel architectuur en maakt het weefsel opslag en transport bij RT, maar inactiveert ook enzymen en crosslinks eiwitten noodzakelijk verdere stappen om nauwkeurige immunokleuring bereiken. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).
Materials
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029 |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as ‘gold standard’ for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
