Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.
Valutazione istologica delle biopsie muscolari ha servito come uno strumento indispensabile per la comprensione dello sviluppo e la progressione della patologia di malattie neuromuscolari. Tuttavia, al fine di fare ciò, cura adeguata deve essere presa quando asportare e conservare tessuti per ottenere la colorazione ottimale. Un metodo di conservazione del tessuto comporta fissa tessuti in formaldeide e poi incorporare con la cera di paraffina. Questo metodo mantiene la morfologia bene e consente la memorizzazione a lungo termine a temperatura ambiente, ma è pesante e richiede una gestione di sostanze chimiche tossiche. Inoltre, i risultati di fissazione formaldeide in antigene cross-linking, che richiede protocolli di recupero antigene per immunocolorazione efficace. Al contrario, sezionamento congelati non richiede fissazione e mantiene quindi biologica dell'antigene conformazione. Questo metodo fornisce anche un netto vantaggio in breve tempo di girarsi, il che rende particolarmente utile in situazioni che necessitano di una rapida valutazione istologica come intraoperativa biopsie chirurgiche. Qui si descrive il metodo più efficace di preparazione biopsie muscolari per la visualizzazione con diverse macchie istologiche ed immunologiche.
L'esame di istologia muscolare gioca un ruolo fondamentale nella comprensione dei diversi tipi di malattie neuromuscolari 1-4. Quando combinato con altre tecniche, permette ai ricercatori di avere una migliore idea della manifestazione e la progressione della patologia e possono anche essere essenziale per valutare l'efficacia di un intervento terapeutico 5-10. Tuttavia, per essere precisi, i tessuti devono essere conservati in modo appropriato in modo da preservare lo stato fisiologico immediatamente prima escissione. Ciò richiede grande attenzione durante la rimozione, la conservazione, il sezionamento, e la colorazione.
I tessuti possono essere preparati in due modi diversi per luce studio microscopico. Il primo metodo, fissati in formalina paraffina (FFPE) sezioni, richiede tessuti da fissare nel 10% naturale formaldeide tamponata prima di essere embedded con paraffina 11,12. La fase di fissazione aiuta a preservare la morfologia meglio, ma anche link incrociati pr endogenooteins e perciò necessitano di procedure di recupero antigene intricato per immunostaining ed eliminando la possibilità di colorazione enzimatica su tali sezioni 12. Sezioni congelate, d'altra parte, non devono essere pre-fisso o trasformati; Pertanto, le proteine sono in grado di trattenere conformazioni biologici nativi 13,14. Inoltre, sezioni congelate consentono anche il tempo di risposta rapido, che a volte è necessario, ad esempio nella diagnosi intraoperatoria di sarcomi e altri biopsie chirurgiche 15. Tuttavia, se non fatto correttamente, questo metodo è soggetto a danni dovuti al ghiaccio, che introduce modifiche all'architettura muscolare rendendo sezioni inadatti per l'esame istologico. Questo documento illustrerà il metodo più efficace per preparare biopsie muscolari per raggiungere colorazione ottimale per un esame adeguato.
Istologia e immunoistochimica sono stati utilizzati come strumenti chiave per comprendere la manifestazione e la progressione della patologia in vari disturbi neuromuscolari. Classicamente, biopsie muscolari sono stati fissati prima di formaldeide e poi integrati con paraffina. Mentre fissazione formaldeide conserva l'architettura dei tessuti e permette lo stoccaggio dei tessuti e il trasporto a temperatura ambiente, è inattiva anche enzimi e proteine legami crociati che richiedono ulteriori misure per raggiu…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).
Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific |
Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus |
Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph |
Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029 |
OCT | 4583 | Sakura Inc. | Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem |
Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific |
Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |