قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
قوة الذرية المجهر (AFM) يولد صورة لسطح عن طريق المسح الضوئي عبر منطقة من العينة باستخدام ناتئ مع طرف حاد جدا 1. حركة ناتئ المسابير طوبولوجيا سطح العينة. وقد تم تطبيق AFM على نطاق واسع لجزيئات البيولوجية – بما في ذلك البروتينات والحمض النووي، والأغشية، نظرا لتنوعها في تحليل عينات الثابتة في الهواء أو دولة شبه الأم في السائل 2-5.
وبصرف النظر عن قدرتها التصوير عالية الدقة في نطاق نانومتر، يعمل ناتئ AFM بمثابة ربيع للتحقيق القوات التفاعل (التصاق والتنافر) والخواص الميكانيكية للعينة 5،6. هذا هو المعروف باسم قوة التحليل الطيفي. في هذا الوضع، وتحقيق نهج أول العينة ويمارس قوة على ذلك، ومن ثم تراجع حتى أنه يفقد الاتصال مع العينة (الشكل 1A). تظهر منحنيات ولدت القوة كدالة للمسافة ناتئ لكل من التطبيقصرصور وتراجع. العديد من الخصائص بما في ذلك معامل المرونة لقياس صلابة من المواد، وقوات التصاق يمكن أن تستمد.
طبقات ثنائية الدهون المعتمدة هي الأغشية البيولوجية نموذج الكذب على رأس دعم قوي – عادة الميكا، والزجاج البورسليكات، السيليكا تنصهر فيها، أو المؤكسد السيليكون 7. انهم مستعدون باستخدام تقنيات مختلفة مثل ترسب حويصلة، طريقة انجميور-بلودجيت وتدور طلاء 8،9. وقد استخدم التصوير AFM لمتابعة تشكيل هذه طبقات ثنائية بدعم 10، وتحقيق مختلف الهياكل التي شكلتها أغشية تركيبات مختلفة 11-15.
أداء قوة التحليل الطيفي على النتائج طبقات ثنائية المعتمدة في قمة في منحنى النهج. هذه الذروة تشير إلى القوة اللازمة لاختراق طبقة ثنائية، ويسمى القوة الخارقة. كما يمكن قياس سمك طبقة ثنائية باستخدام منحنى القوة 6. قوة اختراق نموذجية من طبقات ثنائيةتتراوح ما بين 1-50 ن ن 6. هذه الخصائص تعتمد على التعبئة الدهون (المرحلة سائل أو هلام) وهيكل (أسيل طول السلسلة ودرجة التشبع) وتعديلها من قبل غشاء نشط وكلاء 16. وقد شرحت النظرية وراء القطيعة 17 والمعلمات تجريبية أخرى مثل النعومة ناتئ، دائرة نصف قطرها طرف وسرعة نهج تؤثر أيضا على قوة اختراق 15،16،18. وقد استخدمت القوة الطيفي لتحليل خصائص مراحل مختلفة الدهون 11،19، والتغيرات التي تعتمد على تكوين 12،20، فضلا عن آثار الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الببتيدات، على استقرار الغشاء 21.
التوجه شقة من طبقات ثنائية معتمد من المفيد للجمع بين AFM مع وسائل أخرى مثل مأكل سطح الرنين 22 ومضان المجهر 11،19 لتوصيف هيكل وخصائص الأغشية بشكل أفضل.
هذا بروتو فيديو تفصيليوالمقصود العقيد لإعداد طبقات ثنائية الدهون تدعم استغلال ترسب الحويصلة وتحليلها مع AFM وقوة التحليل الطيفي. في حين الحويصلات من مختلف الأحجام يمكن استخدامها لإعداد طبقات ثنائية، ويركز هذا البروتوكول على الحويصلات unilamellar الصغيرة والكبيرة. وتميزت بدعم طبقات ثنائية تلك المرحلة تفصل في أمر السائل (L س) والسائلة المختلين (L د) مراحل 11،15. ويتكون الغشاء من دى oleoyl-فسفاتيديل (DOPC)، سفينغوميالين (SM)، والكولسترول (شول) في 2: 2: 1 النسبة. هذه نماذج تكوين الطوافات الدهنية، والتي من المقترح أن تتصرف كما منابر هامة للاتجار البروتين والفرز، مما يشير الى الخلايا والعمليات الخلوية الأخرى 23،24.
Protocol
Representative Results
Discussion
SLBs تتألف من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) تشكلت على الميكا بعد الامتزاز الحويصلة وتمزق الناجمة عن كلوريد الكالسيوم. هذه التركيبة الدهنية فصل إلى L د وL س مراحل. وأثرى مرحلة L س في سفينغوميالين والكوليسترول وأقل السائل / أكثر لزوجة (الشكل 1A) من د مرحلة …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك، والمركز الألماني لأبحاث السرطان، وجامعة توبنغن، وBundesministerium FÜR Bildung اوند Forschung (منح رقم 0312040).
نشكر ادوارد هيرمان لمساعدتنا أتمتة تحليل البيانات منحنى القوة والدكتور جاكوب Suckale للقراءة متأنية لهذه المخطوطة.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
- Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
- Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
- Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. . Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
- Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
- Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
- Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. . ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
- Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
- Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
- Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
- Butt, H. -. J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
- Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
- Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
- Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
- García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
- Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
- Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
- Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
- Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
- Butt, H. -. J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
- Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
- Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
- Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
- Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
- Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
- Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
- Rigaud, J. -. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).
