Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
Atomik Kuvvet mikroskopisi (AFM), çok keskin ucu 1 ile konsol kullanılarak numunenin bir alanı boyunca tarama bir yüzeyin bir görüntü oluşturur. konsol hareketi numunesinin yüzey topolojisini araştırıyor. Sıvı 2-5 hava ya da doğala yakın halde sabit örnekleri analiz çok yönlülüğünü nedeniyle, protein, DNA, ve membran da dahil olmak üzere – AFM yaygın biyolojik moleküllerin uygulanmıştır.
Apart nanometre aralığında, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yeteneği gelen, AFM konsol etkileşim kuvvetlerini (yapışma ve itme) ve örnek 5,6 mekanik özelliklerini araştırmak üzere bir yay gibi davranır. Bu kuvvet spektroskopisi diye bilinmektedir. Bu modda, prob birinci numune (Şekil 1A) ile temasını kaybeder kadar daha sonra geri çekilir, örnek yaklaşır ve bunun üzerine bir kuvvet uygular. oluşturulan eğriler uygulama hem de konsol mesafenin bir fonksiyonu olarak kuvvet gösterirhamamböceği ve geri çekilme. Elastikiyet modülüne dahil olmak üzere birçok özellikler, bir malzemenin sertliğini ölçmek için, ve yapışma güçleri elde edilebilir.
Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır bir katı destek üstünde yatan biyolojik model membranlar – genellikle mika, borosilikat cam, erimiş silis veya silikon 7 oksitlenmiş. Bunlar vesikül birikimi gibi çeşitli teknikler kullanılarak hazırlanmaktadır, Langmuir-Blodgett yöntemi ve 8,9 spin kaplama. AFM görüntüleme bu desteklenen ikili tabakalar 10 oluşumunu takip ve farklı bileşimler 11-15 membranları tarafından oluşturulan farklı yapıları incelemek için kullanılmıştır.
Yaklaşım eğrisi de bir zirve desteklenen bilayers sonuçlarına kuvvet spektroskopisi gerçekleştirme. Bu zirve bilayeri delmek için gerekli kuvveti gösterir ve atılım kuvvet denir. iki tabakalı kalınlığı da kuvvet eğrisi 6 kullanılarak ölçülebilir. bilayers tipik atılım gücü1-50 arasındaki aralık NN 6. Bu özellikler, lipit ambalaj (sıvı veya jel fazı) ve yapının (asil zincir uzunlukları ve doymamışlık derecesi) ve zar-aktif maddeler 16 tarafından değiştirilmiş bağlıdır. rüptür arkasındaki teori 17 açıklanmıştır ve bu konsol yumuşaklık, uç yarıçapı ve yaklaşım hızı gibi diğer deneysel parametreler de atılım gücü 15,16,18 etkiler. Kuvvet spektroskopisi zar 21 stabilitesi, farklı lipit fazları 11,19, peptidler gibi bir bileşim bağımlı değişiklikler 12,20, hem de diğer biyomoleküllerin etkileri özelliklerini analiz etmek için kullanılmıştır.
Desteklenen iki katmanlı yassı yönelimi daha iyi bir yapı ve membran özelliklerini karakterize etmek için bu yüzey plazmon rezonans 22 ve floresan mikroskobu 11,19 gibi diğer yöntemler ile AFM birleştirilmesi için avantajlıdır.
Bu ayrıntılı video protocol vezikül birikimi kullanarak desteklenen lipit katmanlarını hazırlamak ve AFM ve kuvvet spektroskopisi ile bunları analiz etmek amaçlanmaktadır. Çeşitli büyüklüklerde veziküller iki katmanlı yapılar hazırlamak için kullanılabilir olsa da, bu protokol, küçük ve büyük tek lamelli vesiküller odaklanmaktadır. Faz sıvı emretti (ğ) ve sıvı düzensiz (L d) aşamalarında ayırmak Desteklenen bilayers 11,15 karakterize edildi. 2: 1 oranında membran 2 di-oleoil-fosfatidilkolin (DOPC), sfingomiyelin (SM) ve kolesterol (kol) oluşmaktadır. Bu kompozisyon modelleri, protein kaçakçılığı ve sıralama, hücre sinyalizasyon ve diğer hücresel süreçleri 23,24 önemli platformlar olarak davranmaya önerilmiştir lipid sallar.
Protocol
Representative Results
Discussion
DOPC oluşan SLBs: SM: Kol (2: 2: 1), kalsiyum klorür ile indüklenen vezikül adsorpsiyon ve yırtılması sonrasında mika oluşmuştur. Bu lipit kompozisyonu L D ve L değeri O fazlar ayrıldı. Ğ fazı sfingomyelin ve kolesterol açısından zengin ve L, D aşaması 11'den daha az sıvı / daha viskoz (Şekil 1A) olarak bulunmuştur. L d aşamasından L o ayrılması çevreleyen (Şekil 1B, C) y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser (no. 0312040 hibe) Max Planck Kurumu, Alman Kanser Araştırma Merkezi, Tübingen Üniversitesi ve Bundesministerium für Bildung und Forschung tarafından desteklenmiştir.
Biz bize bu yazının dikkatli okumak için kuvvet eğrisi verileri ve Dr. Jakob Suckale analizi otomatik yardım için Eduard Hermann teşekkür ederiz.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
- Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
- Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
- Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. . Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
- Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
- Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
- Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. . ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
- Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
- Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
- Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
- Butt, H. -. J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
- Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
- Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
- Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
- García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
- Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
- Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
- Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
- Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
- Butt, H. -. J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
- Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
- Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
- Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
- Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
- Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
- Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
- Rigaud, J. -. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).
