Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
Atomic Force Microscopy (AFM) genereert een beeld van een oppervlak door het scannen van een gebied van het monster met een vrijdragende ligger met een zeer scherpe punt 1. De beweging van de cantilever sondes het oppervlak topologie van het monster. AFM is op grote schaal toegepast om biologische moleculen – zoals eiwitten, DNA en membranen vanwege zijn veelzijdigheid analyseren gefixeerde monsters in lucht of bijna-natieve toestand in vloeibare 2-5.
Afgezien van de hoge-resolutie beeldvorming vermogen in het nanobereik, de AFM cantilever werkt als een veer interactiekrachten (adhesie en afstoting) en mechanische eigenschappen van het monster 5,6 sonde. Dit staat bekend als kracht spectroscopie. In deze modus wordt de eerste probe nadert het monster en een kracht uitoefent op, dan wordt teruggetrokken totdat het contact verliest met het monster (Figuur 1A). De gegenereerde curven kracht als functie van de afstand van de cantilever voor zowel appvoorn en intrekken. Verschillende eigenschappen inclusief de elasticiteitsmodulus de stijfheid van een materiaal te meten, en adhesie krachten kunnen worden afgeleid.
Ondersteunde lipide bilagen zijn biologische modelmembranen liggen boven op een vaste drager – gewoonlijk mica, borosilicaatglas, kwartsglas of geoxideerd silicium 7. Ze worden bereid met behulp van verschillende technieken zoals blaasje depositie, Langmuir-Blodgett methode en de spin-coating 8,9. AFM beeldvorming wordt gebruikt om de vorming van deze ondersteunde dubbellagen 10 volgen en sonde verschillende structuren gevormd door membranen met verschillende samenstellingen 11-15.
Het uitvoeren van kracht spectroscopie op ondersteunde bilayers resulteert in een piek in de aanpak curve. Deze piek geeft de kracht nodig om de bilaag doorboren, en heet doorbraak kracht. De dubbellaag dikte kan ook worden gemeten met de krachtcurve 6. De typische doorbraak kracht van dubbellagenrange tussen 1-50 nN 6. Deze eigenschappen zijn afhankelijk van lipiden verpakking (vloeibare of gelfase) en structuur (acyl ketenlengte en mate van onverzadiging) en veranderd door membraan-actieve middelen 16. De theorie achter de breuk is uitgelegd 17 en andere experimentele parameters zoals cantilever zachtheid, tip radius en aanpak van de snelheid ook van invloed op de doorbraak kracht 15,16,18. Force spectroscopie werd gebruikt om de eigenschappen van verschillende lipide fasen 11,19, preparaat-afhankelijke veranderingen 12,20, en effecten van andere biomoleculen, zoals peptiden analyseren op de stabiliteit van het membraan 21.
De vlakke oriëntatie ondersteunde bilagen voordelig te combineren AFM met andere methoden zoals oppervlakte plasmon resonantie 22 en fluorescentiemicroscopie 11,19 beter te karakteriseren structuur en eigenschappen van de membranen.
Deze gedetailleerde video protocol is bedoeld om ondersteund lipidendubbellagen bereiden met behulp van blaasje afzetting en analyseren ze met de AFM en de kracht spectroscopie. Hoewel vesicles met verschillende grootte worden gebruikt om dubbellagen bereiden dit protocol is gericht op kleine en grote unilamellaire vesicles. Ondersteunde dubbellagen die fase scheiden in vloeibare besteld (L o) en vloeibare ongeordende (L d) fasen werden gekenmerkt 11,15. Het membraan bestaat uit di-oleoyl-fosfatidylcholine (DOPC), sfingomyeline (SM), en cholesterol (Chol) en 2: 2: 1 ratio. Deze samenstelling modellen de lipide vlotten, die worden voorgesteld om zich te gedragen als platforms van belang voor eiwit mensenhandel en sorteren, cell signaling en andere cellulaire processen 23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
SLBs samengesteld DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) gevormd op mica na vesicle adsorptie en scheuren geïnduceerd door calciumchloride. Deze lipidepreparaat gescheiden in Ld en L o fasen. De Lo fase verrijkt met cholesterol en sfingomyeline en is minder vloeibaar / viskeus (figuur 1A) dan Ld fase 11. De scheiding van Lo van Ld fase manifesteert als cirkelvormige structuren boven de omringende (Figuur 1B, C) verhoo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Max Planck Society, de Duitse Cancer Research Center, de universiteit van Tübingen en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (verlenen no. 0312040).
Wij danken Eduard Hermann voor het helpen ons de analyse van de kracht curve gegevens en Dr. Jakob Suckale voor een zorgvuldige lezing van dit manuscript automatiseren.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
- Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
- Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
- Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. . Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
- Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
- Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
- Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. . ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
- Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
- Domènech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
- Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
- Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
- Butt, H. -. J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
- Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
- Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
- Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
- García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
- Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
- Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
- Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
- Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
- Butt, H. -. J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
- Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
- Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
- Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
- Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
- Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
- Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
- Rigaud, J. -. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).
