الجزيئية التحقيق الأمثل لتحديد معدل الوفيات خلية في الكائن الضوئي (<em> Microcystis الزنجارية</em>) باستخدام التدفق الخلوي
Summary
السكان الميكروبية تحتوي على التجانس الخلية كبيرا، وهو ما يمكن أن تملي السلوك العام. تحليل المسبار الجزيئي من خلال التدفق الخلوي يمكن تحديد الدول الفسيولوجية للخلايا، ولكن تطبيقه يختلف بين الأنواع. وتقدم هذه الدراسة بروتوكول لتحديد بدقة وفيات خلية ضمن مجموعة من السكان cyanobacterium، دون التقليل أو تسجيل نتائج إيجابية كاذبة.
Abstract
وقد ثبت القطعان الميكروبية في الدراسات الميدانية والمختبرية لعرض التجانس عالية في المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية. تحديد الدولة في الوقت الحقيقي من خلية الميكروبية تتجاوز فئات حية أو ميتة، والميكروبات يمكن أن توجد في حالة سبات، حيث يتم تخفيض انقسام الخلايا والأنشطة الأيضية. نظرا للحاجة إلى الكشف وتقدير من الميكروبات، التدفق الخلوي (FCM) مع تحقيقات الجزيئية يوفر طريقة سريعة ودقيقة للمساعدة في تحديد قابلية السكان عموما. باستخدام SYTOX الأخضر والبرتقالي SYTOX في البكتيريا الزرقاء نموذج Microcystis الزنجارية للكشف عن سلامة الغشاء، ونحن نطور طريقة تحويل للدلالة السريع وفيات خلية واحدة. سيتم إحالة تحقيقات الجزيئية المستخدمة في هذه المجلة لتحقيقات الحمض النووي الخضراء كما أو البرتقال على التوالي (على الرغم من أن هناك منتجات أخرى مماثلة مع الإثارة وانبعاث موجات التي لديها وسائط قابلة للمقارنة من التدبير العمومين، ونحن على وجه التحديد الرجوع إلى ذكر في المقدمة تحقيقات). البروتوكولات باستخدام المجسات الجزيئية تختلف بين الأنواع، واختلاف أساسي في التركيز وحضانة مرات. بعد هذا البروتوكول المبينة على M.aeruginosa وكان محسن الأخضر التحقيق الحمض النووي بتركيزات من 0.5 ميكرومتر بعد 30 دقيقة من الحضانة والتحقيق الحمض النووي البرتقال في 1 ميكرومتر بعد 10 دقيقة. في كل تحقيقات تركيزات أقل من المستوى الأمثل ذكرت أدى إلى تحت الإبلاغ عن الخلايا مع الضرر الغشاء. على العكس، 5 ميكرومتر تركيزات وأعلى في كل من التحقيقات أظهرت نوع من تلطيخ غير محددة، حيث الخلايا الحية 'أنتجت مضان المستهدفة، مما يؤدي إلى تمثيل أكثر من الأرقام "غير قابلة للحياة" الخلية. قدمت الضوابط الإيجابية (قتل الحرارة) الكتلة الحيوية الميتة قابلة للاختبار، على الرغم من ملاءمة الجيل السيطرة لا تزال تخضع للمناقشة. من خلال إظهار تسلسل منطقي من الخطوات لتحسين الأخضر والبرتقالي تحقيقات الحمض النووي دي نحنmonstrate كيفية إنشاء بروتوكول التي يمكن استخدامها لتحليل الحالة الفسيولوجية السيانوبكتيريا على نحو فعال.
Introduction
الخلية هي نظام معقد، الذي يستجيب باستمرار على البيئة عن طريق تعديل المعلمات الفسيولوجية وتغيير وظيفتها. تتأثر ديناميات السكان السكان الميكروبية إسوي سواء في طبيعة والمختبر من خلال تطوير القطعان، والتي تحدث حتى في ظل الظروف البيئية ثابتة نسبيا 1-3. تباين المجتمعات الميكروبية الطبيعية ينشأ بسبب الطبيعة المتغيرة للغاية من الظروف البيئية. هذه العمليات العشوائية وأحيانا ما تنتج في وقت لاحق القطعان التي هي مختلفة جدا إلى متوسط عدد السكان. وكشفت أدلة حديثة أن هذه القطعان الفسيولوجية تستجيب بشكل مختلف للظروف البيئية، ويمكن أن تنتج مركبات إشارة أو مثبطات التي تؤثر بشكل كبير والتأثير على 3،4 إجمالي عدد السكان.
إنشاء وسيلة لتحديد عدم التجانس بين السكان هو المفتاح لبرنامج الأمم المتحدةderstanding البيئة الميكروبات في بيئات مختلفة وضروري عند بناء المعرفة من البكتيريا الزرقاء إزعاج، مثل Microcystis السامة، مما يؤثر بشكل كبير على الأمن المائي البشري. الأنواع مثل أنابينا عرض التجانس الشكلي في استجابة لتقلبات البيئة، وتطوير خلايا متخصصة مثل heterocysts وakinetes 2. في المقابل، خلايا Microcystis لا تعرض التجانس الشكلي واضحا خلال الاستجابة للضغط النفسي. التمييز بين خلايا قابلة للحياة وغير قابلة للحياة هو الجانب الأكثر أهمية التمايز الفسيولوجية ويسمح فهم أفضل للديناميات السكانية الميكروبية. ومع ذلك، تبقى المشكلة المفاهيمية للبقاء البكتيرية نفسها صعبة وسيئة تتميز 1،5،6.
التدفق الخلوي (FCM) هي طريقة موثوقة وسريعة لتحليل الخلايا الفردية. لزيادة فهم طبيب خلية واحدةبليد الحركة من خلال FCM، وقد استخدمت تحقيقات الجزيئية للتمييز عدد من الأيض والعمليات الحيوية (7). وقد أدى ذلك إلى زيادة المعرفة الأنواع على المستوى الخلوي والسكان، وهذا بدوره ساعد في إدارة الموارد المائية 8،9. ومع ذلك، الكائنات الحية تختلف من حيث الجزيئي امتصاص التحقيق وهروب رأس المال بسبب المسام ومضخات في الجدران الخلوية والأغشية، والتي أدت إلى عدد من الجزيئية تصميم التحقيق وتنفيذ بروتوكول 6،10،11. وغالبا ما زودت الاختبارات الجزيئية المتاحة لأغراض تجارية والبحوث مع بروتوكول عام والتي يمكن أن تنطبق على نوع من الخلايا مختلفة جدا. يجب على المرء أن يكون حذرا جدا في نقل البروتوكولات وضعت لنوع خلية واحدة إلى 6 آخر، وبالتالي هو المهمة الأساسية لتحسين تحقيقات الجزيئية فعال قبل الاستخدام.
تحقيقات الحمض النووي الأخضر والبرتقالي ربط إلى كل من الأحماض النووية مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل مع الحد الأدنى من قاعدة حددتستخدم ivity وتقييم سلامة الغشاء البلازمي للخلايا. التحقيق الحمض النووي الأخضر يحتوي على طرأ تحسن ملحوظ على وضع العلامات الخلية إشارة مضان مقارنة تحقيقات الجزيئية الأخرى، مثل مركبات القائم على يوديد propidium 12، والتي يمكن أيضا بمثابة مؤشر على بقاء الخلية. مصطلح "بقاء الخلية" هنا يفترض أن تدهور الحمض النووي يحدث بعد فقدان النزاهة غشاء البلازما. تحقيقات الحمض النووي هي cyanine الأصباغ غير متماثل مع ثلاثة الشحنات الموجبة، ولا يمكن دخول الخلايا مع أغشية سالمة تحت تركيزات تتميز، في كل من حقيقيات النوى 11،13 و 14،15 بدائية النواة الكائنات الحية. يمكن ربط مسبار الحمض النووي للأحماض النووية يؤدي إلى ما يصل إلى> 500 أضعاف من انبعاثات مضان من الإشارات المحلية في الخلايا التي تحتوي سلامة غشاء للخطر. على الرغم من أن تحقيقات الجزيئية مثل الأخضر التحقيق الحمض النووي يمكن أن يكون مؤشرا جيدا لعلم وظائف الأعضاء خلية واحدة، هناك حاجة رس تحسين كل التحقيق مع كائن الهدف المقصود، كما اختلفت الأوقات الحضانة من 7 دقيقة – 30 دقيقة، وتركيز يتراوح من 0.1 ميكرومتر – 0.5 ميكرومتر في التجارب Microcystis وحده 15-19.
هنا نقدم بروتوكول لتعظيم المقايسات cytometric من اللون الأخضر والبرتقالي تحقيقات الحمض النووي جديدة نسبيا (والتي حتى الآن لم يتم اختباره على أنواع السيانوبكتيريا M.aeruginosa). ويمكن بعد ذلك نقل المنهجية المتقدمة التالية إلى الأنواع الأخرى، وتستخدم كمنصة لتحسين البروتوكولات في تحقيقات الجزيئية الأخرى، وبالتالي زيادة فهم الميكروبات والسلوك البيئي الخاصة بهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأعداد المتزايدة من المنشورات باستخدام المجسات الجزيئية تشير إلى أن بيانات موثوق بها وغنية بالمعلومات ويمكن الحصول على 5،6،8 – 15،19،22،23. اعتبارا من بعد ليس هناك وصمة عار مثالية لبقاء الخلية التي يمكن أن تكون فعالة في جميع الأنواع مع نفس التركيز وحضا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف طالب دكتوراه ديف هارتنل وجامعة بورنموث للحصول على الدعم والتمويل للبحوث والمرافق.
Materials
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min. Followed by 2mins of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A (by request) | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
References
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D., Andersen, R. A. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. , 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?. J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A., Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. , 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
