Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Par cytométrie en flux

Summary

Les populations microbiennes contiennent hétérogénéité cellulaire importante, qui peut dicter le comportement global. L'analyse de la sonde moléculaire par cytométrie en flux peut déterminer états physiologiques de cellules, mais son application varie selon les espèces. Cette étude fournit un protocole de déterminer avec précision la mortalité cellulaire dans une population de cyanobactérie, sans sous-estimer ou l'enregistrement des résultats faussement positifs.

Abstract

Sous-populations microbiennes dans les études de terrain et de laboratoire ont été montré pour afficher une forte hétérogénéité dans les paramètres morphologiques et physiologiques. Déterminer l'état en temps réel d'une cellule microbienne va au-delà des catégories vivants ou morts, que les microbes peuvent exister dans un état dormant, où la division cellulaire et activités métaboliques sont réduits. Compte tenu de la nécessité pour la détection et la quantification des microbes, la cytométrie en flux (FCM) avec des sondes moléculaires fournit une méthode rapide et précise pour aider à déterminer la viabilité globale de la population. En utilisant SYTOX vert et SYTOX Orange dans le modèle cyanobactéries Microcystis aeruginosa pour détecter intégrité de la membrane, nous développons une méthode transférable pour une indication rapide de la mortalité d'une cellule unique. Les sondes moléculaires utilisés dans ce journal seront appelées acides nucléiques sondes en vert ou orange, respectivement (bien qu'il y ait d'autres produits avec excitation et d'émission des longueurs d'onde similaires qui ont un mode de actio comparablesn, nous nous référons spécifiquement à l'avant mentionné sondes). Protocoles utilisant des sondes moléculaires varient entre les espèces, qui diffèrent principalement en concentration et d'incubation fois. Suite à ce protocole défini sur M.aeruginosa la sonde d'acide nucléique vert a été optimisé à des concentrations de 0,5 pm après 30 min d'incubation et de la sonde d'acide nucléique d'orange à 1 uM après 10 min. Dans les deux sondes des concentrations inférieures à la valeur optimale déclaré conduit à une sous-déclaration des cellules avec des dommages à la membrane. Inversement, 5 uM concentrations et supérieur dans les deux sondes ont présenté un type de coloration non spécifique, par lequel les cellules «live» produit une fluorescence cible, conduisant à une sur-représentation du nombre de cellules «non viables». Les contrôles positifs (tuées par la chaleur) fournis biomasse morte testable, bien que la pertinence de génération de commande reste sujet à débat. En démontrant une séquence logique d'étapes pour optimiser les vert et orange acide sondes nucléiques Wé demonstrate comment créer un protocole qui peut être utilisé pour analyser l'état physiologique de cyanobactéries efficacement.

Introduction

La cellule est un système complexe qui répond en permanence à l'environnement par la modification des paramètres physiologiques et modifier sa fonction. La dynamique des populations des populations microbiennes isogéniques à la fois dans la nature et le laboratoire sont affectés par le développement des sous-populations, survenant même dans des conditions relativement constants environnementales ^{1 – 3.} La variabilité des communautés microbiennes naturelles se pose en raison de la nature très variable des conditions environnementales. Ces processus parfois stochastiques produisent ensuite des sous-populations qui sont très différents de la moyenne de la population. Des preuves récentes ont révélé que ces sous-populations physiologiques répondent différemment à des conditions ambiantes et peut produire des composés de signal ou des inhibiteurs qui affectent de façon spectaculaire et influent sur ​​l'ensemble de la population ^3,4.

Établir une méthode pour définir l'hétérogénéité au sein d'une population est la clé de l'ONUcompré- l'écologie des microbes dans divers environnements et est essentielle lors de la construction des connaissances des cyanobactéries indésirables, tels que le Microcystis toxiques, ce qui affecte lourdement sur ​​la sécurité humaine de l'eau. Les espèces telles que Anabaena afficher hétérogénéité morphologique en réponse aux fluctuations de l'environnement, le développement des cellules spécialisées comme hétérocystes et akinètes ^2. En revanche, les cellules de Microcystis ne présentent pas l'hétérogénéité morphologique évidente lors d'une réaction de stress. La discrimination entre les cellules viables et non viables est l'aspect le plus important de différenciation physiologique et permet une meilleure compréhension de la dynamique des populations microbiennes. Cependant, le problème conceptuel de la viabilité bactérienne elle-même reste difficile et mal caractérisé ^1,5,6.

La cytométrie en flux (FCM) est une méthode fiable et rapide d'analyse de cellules individuelles. Pour augmenter la compréhension de kiné seule cellulelogie entremise de la FCM, sondes moléculaires ont été utilisés pour distinguer un certain nombre de processus métaboliques et biochimiques ^7. Cela a conduit à une meilleure connaissance des espèces à un niveau cellulaire et de la population et à son tour aidé gestion de l'eau ^8,9. Cependant, les organismes diffèrent en termes de capture de la sonde moléculaire et efflux en raison des pores dans les murs et les pompes et les membranes cellulaires, qui ont conduit à un certain nombre de conception de la sonde moléculaire et la mise en œuvre du protocole ^6,10,11. Sondes moléculaires disponibles à des fins commerciales et de recherche sont souvent fournis avec un protocole générique qui peut être applicable à un type de cellule très différent. Il faut être très prudent dans le transfert de protocoles développés pour un type de cellule à l'autre ^6, il est donc une tâche essentielle pour optimiser sondes moléculaires efficacement avant utilisation.

Les sondes d'acide nucléique vert et orange se lient à la fois des acides doubles et nucléique simple brin avec une base minimale sélectionnezivité et sont utilisés pour évaluer l'intégrité de la membrane plasmique des cellules. La sonde d'acide nucléique vert a un signal de fluorescence de marquage cellulaire nettement améliorée par rapport aux autres sondes moléculaires, tels que les composés à base d'iodure de ^{propidium-12,} qui peut également agir comme un indicateur de la viabilité cellulaire. Le terme «viabilité cellulaire 'ici suppose que la dégradation de l'ADN se produit après la perte de l'intégrité de la membrane plasmique. Les sondes d'acide nucléique sont des colorants cyanine asymétriques avec trois charges positives et ne peuvent pas pénétrer dans les cellules avec des membranes intactes, caractérisé en vertu des concentrations, dans les deux eucaryotes et procaryotes ^{14,15 11,13} organismes. La liaison d'une sonde d'acide nucléique à des acides nucléiques peut entraîner jusqu'à une augmentation d'un facteur> 500 des émissions de fluorescence à partir de signaux endogènes dans des cellules qui ont leur intégrité membranaire compromise. Bien que sondes moléculaires tels que la sonde d'acide nucléique vert peut être un bon indicateur de la physiologie de la cellule unique, il ya un besoin to optimiser chaque sonde avec l'organisme cible prévue, que les temps d'incubation varient de 7 min – 30 min et les gammes de concentration de 0,1 uM – 0,5 pM dans des expériences Microcystis seul ^15-19.

Nous présentons ici un protocole d'optimiser les dosages de cytométrie de vert et relativement nouvelles sondes d'acide nucléique orange (qui à ce jour pas été testé sur les espèces de cyanobactéries M.aeruginosa). La méthodologie développée suivante peut alors être transféré à d'autres espèces et utilisé comme une plate-forme pour l'optimisation de protocoles dans d'autres sondes moléculaires, augmentant ainsi la compréhension des microbes et leur comportement écologique.

Protocol

1. Préparation de la sonde moléculaire et Cytomètre de flux Diluer solutions d'achat d'actions des sondes d'acide nucléique, qui sont fournis en tant que solution à 5 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à des parties d'concentrations requises ultrapure filtrée H 2 O. Stocker les sondes d'acide nucléique dans des conditions d'obscurité entre -5 ° C et – 25 ° C jusqu'à utilisation. Allumez le cytomètre de flux et de l…

Representative Results

Prodiffusion lumière (FSC) et de la lumière de diffusion latérale (SSC) sorties à partir d'une culture discontinue M.aeruginosa en phase exponentielle fournit des informations sur la taille des cellules (de diamètre) et la granularité interne respectivement (figure 1A). FSC peut distinguer les cellules qui sont trop grands et / ou petits pour être M.aeruginosa. Cette discrimination ou ouverture de porte peuvent être faites p…

Discussion

L'augmentation du nombre de publications utilisant des sondes moléculaires indique que les données fiables et informatifs peuvent être obtenus ^{5,6,8 – 15,19,22,23.} Pour l'instant il n'y a pas de tache parfaite pour la viabilité cellulaire qui peut être efficace dans toutes les espèces avec la même concentration et la durée d'incubation ^{de 6,10.} Même le même type de sonde avec des émissions de fluorescence altérées montre la nécessité d'établ…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO