Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Mittels Durchflusszytometrie
Summary
Mikrobenpopulationen enthalten, die wesentliche Zellheterogenität, das allgemeine Verhalten diktieren können. Molekulare Sonde Analyse durch Durchflusszytometrie können physiologische Zustände von Zellen zu bestimmen, aber ihre Anwendung variiert zwischen den Arten. Diese Studie liefert ein Protokoll, um genau zu bestimmen, Zellmortalität innerhalb von einem Cyanobakterium Bevölkerung, ohne zu unterschätzen oder Aufzeichnungs falsch positiven Ergebnissen.
Abstract
Mikrobielle Subpopulationen in Feld- und Laborstudien haben gezeigt, dass hohe Heterogenität in der morphologischen und physiologischen Parametern. Bestimmen der Echtzeitzustand einer mikrobiellen Zelle geht über lebenden oder toten Kategorien, wie Mikroben in einem Ruhezustand, wobei die Zellteilung und metabolische Aktivität vermindert existieren. Da es notwendig ist für die Detektion und Quantifizierung von Mikroorganismen, Durchflusszytometrie (FCM) mit molekularer Sonden stellt ein schnelles und genaues Verfahren, um festzustellen Gesamtpopulation Lebensfähigkeit. Durch die Verwendung von SYTOX Grüne und orange SYTOX im Modell Cyanobakterien Microcystis aeruginosa, um die Integrität der Membran zu erkennen, entwickeln wir eine übertragbare Methode für die schnelle Anzeige der einzelnen Zelle Sterblichkeit. Die molekulare Sonden in dieser Zeitschrift verwendet wird als grün oder orange Nukleinsäure-Sonden bezeichnet werden (obwohl es auch andere Produkte mit ähnlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen, die eine vergleichbare Formen der actio habenn, die wir ausdrücklich auf die vorderen erwähnten Sonden). Protokolle mit molekularen Sonden variieren zwischen den Arten, die sich hauptsächlich in der Konzentration und Inkubationszeiten. Nach diesem Protokoll auf Microcystis aeruginosa setzen die grüne Nucleinsäuresonde wurde bei Konzentrationen von 0,5 & mgr; M nach 30-minütiger Inkubation und die orange Nucleinsäuresonde bei 1 uM nach 10 min optimiert. In beiden Sonden Konzentrationen von weniger als der angegebenen optimalen Rahmen Berichterstattung von Zellen mit Membranschäden führten zu einem. Umgekehrt, 5 uM Konzentrationen und höher in beiden Proben zeigte eine Art von nicht-spezifischer Färbung, wobei "live" Zellen erzeugt einen Ziel Fluoreszenz, was zu einer überproportionalen Anteil "abgetötet" Zellzahlen. Die positiven Kontrollen (durch Hitze abgetöteten) vorgesehen testbare tote Biomasse, auch wenn die Angemessenheit der Steuerungsgeneration bleibt umstritten. Durch den Nachweis einer logischen Sequenz von Schritten für die Optimierung der grün und orange Nucleinsäuresonden wir demonstrate, wie ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Cyanobakterien physiologischen Zustand effektiv zu analysieren erstellen.
Introduction
Die Zelle ist ein komplexes System, das ständig reagiert auf die Umwelt durch die Beeinflussung der physiologischen Parameter und ihre Funktion zu verändern. Die Populationsdynamik von isogenen mikrobiellen Populationen sowohl in der Natur und das Labor werden durch die Entwicklung von Unterpopulationen betroffen sind, auftreten, auch unter relativ konstanten Umgebungsbedingungen 1-3. Die Variabilität der natürlichen mikrobiellen entsteht durch die hohe Variabilität der Umweltbedingungen. Diese manchmal stochastische Prozesse anschließend produzieren Subpopulationen, die sehr unterschiedlich zu dem Bevölkerungsdurchschnitt liegen. Neuere Erkenntnisse haben ergeben, dass diese physiologischen Subpopulationen reagieren unterschiedlich auf Umweltbedingungen und können Signalverbindungen oder Inhibitoren, die dramatisch beeinflussen und beeinflussen die Gesamtbevölkerung 3,4 herzustellen.
Die Schaffung eines Verfahrens zur Heterogenität innerhalb einer Population zu definieren ist der Schlüssel zu unständnis der Ökologie von Mikroben in verschiedenen Umgebungen und ist von wesentlicher Bedeutung bei der Erstellung Kenntnisse Ärgernis Cyanobakterien, wie die giftigen Microcystis, die Auswirkungen stark auf menschliche Sicherheit der Wasserversorgung. Arten wie Anabaena morphologische Heterogenität als Reaktion auf Umweltveränderungen angezeigt, die Entwicklung von spezialisierten Zellen wie Heterocysten und Akineten 2. Im Gegensatz dazu Microcystis Zellen nicht klar, morphologische Heterogenität während einer Stressreaktion anzuzeigen. Die Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Zellen ist der wichtigste Aspekt der physiologischen Differenzierung und ermöglicht ein besseres Verständnis der mikrobiellen Populationsdynamik. Die konzeptionelle Problem der bakteriellen Lebensfähigkeit selbst bleibt jedoch schwierig und schlecht gekennzeichnet 1,5,6.
Durchflusszytometrie (FCM) ist ein sicheres und schnelles Verfahren zur Analyse von Einzelzellen. Um das Verständnis der einzelnen Zelle physio erhöhenlogy durch FCM, molekularen Sonden sind verwendet worden, um eine Anzahl von metabolischen und biochemischen Prozessen 7 unterscheiden. Dies hat zu mehr Wissen von Arten auf zellulärer und Bevölkerungsebene geführt und im Gegenzug geholfen Wasserressourcenmanagement 8,9. Jedoch unterscheiden sich Organismen hinsichtlich der molekularen Sonde Aufnahme und Ausströmen durch die Poren und die Pumpen in Zellwänden und Membranen, die zu einer Reihe von molekularen Sonde Design und Protokollimplementierung 6,10,11 geführt. Molekularsonden für kommerzielle und Forschungszwecke verfügbar sind oft mit einer generisches Protokoll, die zu einem ganz anderen Zelltyp anwendbar sein kann, geliefert. Man muss sehr vorsichtig beim Übertragen von Protokollen für einen Zelltyp entwickelt, um weitere 6 sein kann, ist es daher eine wesentliche Aufgabe der molekularen Sonden effektiv vor der Verwendung zu optimieren.
Die grüne und orange Nukleinsäuresonden sowohl Doppel-und Einzel Nukleinsäuren mit minimalen Basis binden wählenivität und werden verwendet, um die Plasmamembranintegrität von Zellen zu beurteilen. Die grüne Nukleinsäuresonde eine deutlich verbesserte Zellmarkierung Fluoreszenzsignal im Vergleich zu anderen molekularen Sonden wie Propidiumiodid basierenden Verbindungen 12, die auch als ein Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen wirken kann. Der Ausdruck "die Lebensfähigkeit der Zellen" hier davon aus, dass DNA-Abbau nach dem Verlust der Plasmamembranintegrität auftritt. Die Nucleinsäuresonden sind unsymmetrische Cyaninfarbstoffe mit drei positive Ladungen und können nicht in Zellen mit intakten Membranen unter gekennzeichnet Konzentrationen sowohl eukaryotische als auch prokaryotische 14,15 11,13 Organismen. Der Bindung einer Nukleinsäure-Sonde an Nukleinsäuren in der bis zu einer> 500 fachen Zunahme der Fluoreszenz-Emissionen von endogenen Signalen in Zellen, die ihre Membranintegrität beeinträchtigt haben ergeben. Obwohl molekulare Sonden wie das grün Nucleinsäuresonde kann ein guter Indikator für die einzelne Zellphysiologie zu sein, gibt es einen Bedarf to optimieren jede Sonde mit der beabsichtigten Zielorganismus, wie Inkubationszeiten wurden von 7 min variiert – 30 Minuten und die Konzentration im Bereich von 0,1 & mgr; M – 0,5 & mgr; M in Microcystis Experimente allein 15-19.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die zytometrische Assays von Grün und die relativ neu orange Nukleinsäuresonden (die bisher nicht von den Cyanobakterien Spezies Microcystis aeruginosa getestet) zu optimieren. Folgendes entwickelten Methodik kann dann auf andere Spezies übertragen und als eine Plattform für die Optimierung der Protokolle in anderen molekularen Sonden, wodurch das Verständnis der Mikroben und deren ökologische Verhalten Erhöhung verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die erhöhte Anzahl von Publikationen mit molekularen Sonden zeigt an, dass verlässliche und aussagekräftige Daten erhalten 5,6,8 werden – 15,19,22,23. Als der noch gibt es keine perfekte Färbung für die Lebensfähigkeit der Zellen, die wirksam sein kann für alle Arten mit der gleichen Konzentration und Inkubationszeit 6,10. Sogar die gleiche Art von Sonden mit veränderten Fluoreszenzemissionen zeigt die Notwendigkeit, die richtige Konzentration und Inkubationszeit <stro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Doktorand Dave Hartnell und Bournemouth University für die Unterstützung und Finanzierung für die Forschung und Einrichtungen anzuerkennen.
Materials
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min. Followed by 2mins of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A (by request) | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
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