Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Dit protocol beschrijft de productie van acellulaire, maar biofunctionele, renale extracellulaire matrix (ECM) scaffolds die bruikbaar zijn als schaalmodel substraten voor orgaan- schaal weefselvorming zijn. Sprague Dawley ratten nieren gecannuleerd door het inbrengen van een katheter in de nierslagader en geperfuseerd met een reeks van lage-concentratie detergentia (Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat (SDS)) gedurende 26 uur aan intacte, hele nier scaffolds met intacte ontlenen perfusable vaatstelsel, glomeruli, en nierbuisjes. Na decellularisatie wordt de renale steiger geplaatst in een speciaal ontworpen perfusie bioreactor vat en de katheter nierslagader is verbonden met een perfusie circuit bestaat uit: een peristaltische pomp; buizen; en optionele sondes voor pH, opgeloste zuurstof en druk. Na het steriliseren het schavot met perazijnzuur en ethanol, en het balanceren van de pH (7,4), wordt de nier steiger voorbereid voor het zaaien via perfusie van kweekmedium binnen een large-vermogen incubator gehandhaafd bij 37 ° C en 5% CO 2. Veertig miljoen renale corticale tubulaire epitheel (RCTE) cellen worden geïnjecteerd door de nierslagader en snel geperfuseerd via scaffold onder hoge stroming (25 ml / min) en druk (~ 230 mmHg) gedurende 15 min voor het reduceren van de stroom naar een fysiologische tempo (4 ml / min). RCTE cellen vooral bevolken de buisvormige ECM niche binnen de renale cortex, vermenigvuldigen en vormen tubulaire epitheliale structuren meer dan zeven dagen van perfusie cultuur. Een 44 uM resazurin oplossing in kweekmedium wordt doorbloed door de nieren gedurende 1 uur tijdens medium beurzen een fluorometrische, redox-gebaseerde metabole beoordeling van de levensvatbaarheid en de proliferatie cel bieden tijdens tubulogenesis. De nier perfusiebioreactor maakt niet-invasieve bemonstering van medium voor biochemische evaluatie, en meerdere inlaatpoorten mogelijk alternatief retrograde zaaien door middel van de renale ader of urineleider. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om nier scaffolds met recellularizeverscheidenheid van celtypen, met inbegrip van vasculaire endotheliale, tubulaire epitheliale en stromale fibroblasten, voor een snelle evaluatie binnen dit systeem.
Introduction
Aangezien het aantal patiënten met eindstadium nierfalen blijft toenemen, is er een ernstig en toenemend tekort in het aantal donornieren voor transplantatie beschikbaar. Het onvermogen om de vraag van een steeds toenemende aantal kandidaten voldoen wachten-vermeld voor niertransplantatie heeft onderzoek in de nier orgel techniek gevraagd met het uiteindelijke doel van het ontwikkelen van op maat gemaakte, implanteerbare nier enten op aanvraag 1,2. Capaciteit opzetten nierweefsel uit eigen cellen van de patiënt zou de noodzaak van levenslang immunosuppressie elimineren, de hoeveelheid tijd die patiënten besteden dialyse wachten op een niertransplantatie verminderen en verlengt levensreddende transplantatie meer patiënten met chronische nierziekte.
De eerste stap naar een bioengineeringtechnieken nierweefsel behulp patiënt afgeleide cellen is een scaffold dat dient als een ondersteunend substraat voor renaal parenchym ontwikkelen (bijvoorbeeld buisvormig epitheLial), stroma fibroblasten en vasculaire celgroei. Biomaterialen afkomstig van natuurlijke orgel extracellulaire matrix (ECM) hebben een aantal kenmerken die hen wenselijk zijn voor gebruik in de tissue engineering, met inbegrip van hun natuurlijke biologische samenstelling maken; juiste macro- en microstructuur om fysiologische functie te voorzien; en cellulaire biocompatibiliteit, bevorderen celhechting, migratie en constructieve tissue remodeling 3. Een veelbelovende werkwijze voor scaffolds voor renaal weefselregeneratie te produceren is door middel van cellen ontdoen van allogene of xenogene nieren dat veel van de complexe natuurlijke eiwitsamenstelling van de nier ECM 4 behouden, behouden de inherente architecturale complexiteit van het orgaan, en het overwinnen van de problemen in verband met bodem- up engineering van dikke cellularized weefsels door middel van een vasculaire levering aan de ontwikkeling van cellen na scaffold hercellularisatie 5.
Perfusie decellularisatie is een procesdie detergentia, enzymen, of andere cellen verstoren oplossingen gelijkmatig afgegeven door het vasculaire netwerk van het orgaan 6. Deze strategie is vastgesteld als een efficiënt proces een cellulaire-orgaan gebaseerde ECM scaffolds afgeleid driedimensionale (3D), biologische templates voor volle-organen 6-8 techniek, zoals blijkt uit de ontwikkeling van acellulaire renale templates uit afgedankte menselijke nieren 9 en xenogene nieren afkomstig van grote dieren (bijvoorbeeld 10 varken, geit 11) en knaagdieren bronnen 12. Met name het gebruik van kleine diermodellen zoals knaagdieren vergt minder cellen en kweekmedia, wat vooral nuttig voor orgel hercellularisatie studies waarin celaantallen meestal beperkt, zoals het geval is met stamcellen afgeleide weefsels. Het doel van de beschreven decellularisatie protocol is een acellulair nier ECM die kunnen worden gebruikt als een 3D steiger voor de regeneratie van nieren structur producerenes, waaronder nefron tubuli die herbevolkt dit voorbeeld menselijke renale corticale tubulaire epitheel (RCTE) cellen. We eerder beschreven onze strenge evaluatie van een optimale, detergens gebaseerde rat kidney ontcelling protocol 7, die sneller (ongeveer een dag) dan andere methoden eerder beschreven (Ross et al .- 5 dagen 12, Song et al .- 4,5 dagen 13), en onthult het orgel in aanzienlijk lagere concentratie (0,1%) van het denaturerende natriumdodecylsulfaat (SDS) in cellen ontdoen dan eerdere rapporten 12-15.
Een beperkt aantal studies hebben het gebruik van knaagdieren nieren voor decellularisatie en het daaropvolgende gebruik als een 3D scaffold voor cellulaire herbevolking beschreven 12-16 (elders beoordeeld 1). In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van onze eerder vastgestelde optimale strategie voor het produceren van cellen ontdoen acellulair nier scaffoldsvan Sprague Dawley rat nieren 7. Met behulp van speciaal ontworpen perfusie bioreactoren staat dual zaaien en onderhoud perfusie cultuur 17, recellularize we de acellulaire nieren steigers met menselijke RCTE cellen, die consequent de buisvormige component opnieuw te bevolken in deze gedecellulariseerde matrices, vermenigvuldigen en overleven in perfusie cultuur voor meer dan een week. We gebruik van de Resazurin perfusie assay tonen verder – een goedkope, niet-cytotoxisch en niet-invasieve metabole assessment vroeger voor cytotoxiciteit studies 17 – een indicatie van cellevensvatbaarheid en proliferatie in de recellularized nieren verschaffen tijd 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven decellularisatie protocol produceert onder een geheel acellulaire nier ECM die dient als een 3D model voor kweken van menselijke renale corticale tubulaire epitheelcellen (zowel proximale als distale tubulus afgeleide), naast vasculaire endotheelcellen 7,17. De gecanuleerde niervaatstelsel dient als spil voor de uniforme aflevering van reagentia en cellen door het scaffold in een bioreactor set-up, waardoor de doorbloeding decellularisatie, zaaien van cellen, langdurige perfusiekweek en de Resaz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
