La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Este protocolo se detalla la generación de acelular, sin embargo, la matriz extracelular (ECM) andamios biofuncionales, renales que son útiles como sustratos modelo a pequeña escala para el desarrollo de tejidos de órganos escala. Riñones de rata Sprague Dawley se canulan mediante la inserción de un catéter en la arteria renal y perfundidos con una serie de detergentes de baja concentración (Triton X-100 y dodecil sulfato de sodio (SDS)) durante 26 hr para derivar, andamios de todo el riñón intactas con intacto vasculatura perfusable, glomérulos y túbulos renales. Después de la descelularización, el andamio renal se coloca dentro de un recipiente biorreactor de perfusión de diseño personalizado, y la arteria renal sondaje está conectado a un circuito de perfusión que consiste en: una bomba peristáltica; tubos; y sondas opcionales para pH, oxígeno disuelto, y la presión. Después de esterilizar el andamio con ácido peracético y etanol, y equilibrar el pH (7,4), el andamio riñón se prepara para la siembra a través de la perfusión de medio de cultivo dentro de un largincubadora de correo capacidad mantiene a 37 ° C y 5% de CO 2. Cuarenta millones de células renales epiteliales tubular cortical (RCTE) se inyectan a través de la arteria renal, y rápidamente perfundieron a través del andamio bajo alto flujo (25 ml / min) y la presión (~ 230 mmHg) durante 15 min antes de reducir el flujo a una tasa fisiológica (4 ml / min). Células RCTE pueblan principalmente el nicho ECM tubular dentro de la corteza renal, proliferan, y forman estructuras tubulares epiteliales más de siete días de cultivo de perfusión. Una solución de resazurina 44 mM en medio de cultivo se perfunde a través del riñón para 1 hr durante los intercambios de medio para proporcionar una evaluación fluorométrica, basado en redox metabólica de la viabilidad celular y la proliferación durante tubulogenesis. El biorreactor de perfusión de riñón permite el muestreo no invasivo de medio para la evaluación bioquímica, y múltiples puertos de entrada permite la siembra retrógrada alternativa a través de la vena renal o del uréter. Estos protocolos pueden utilizarse para recellularize andamios de riñón con unavariedad de tipos celulares, incluyendo endotelial vascular, epitelial tubular, y los fibroblastos del estroma, para la evaluación rápida dentro de este sistema.
Introduction
Como el número de pacientes que sufren de insuficiencia renal en etapa terminal continúa aumentando, hay una escasez grave y creciente en el número de riñones de donantes disponibles para el trasplante. La incapacidad para satisfacer la demanda de un número continuamente creciente de candidatos en lista de espera para trasplante renal ha llevado a la investigación en ingeniería de órganos de riñón con el objetivo final de desarrollar personalizado, injertos renales implantables bajo demanda 1,2. La construcción de funcionamiento tejido renal de las propias células del paciente se eliminaría la necesidad de inmunosupresión de por vida, disminuir la cantidad de tiempo que los pacientes pasan en diálisis en espera de un trasplante de riñón, y extender el trasplante para salvar la vida a más pacientes con enfermedad renal crónica.
El primer paso hacia la bioingeniería un tejido renal usando células derivadas del paciente es desarrollar un andamio que sirve como un sustrato de apoyo para parénquima renal (por ejemplo epithe tubularlial), fibroblastos del estroma, y el crecimiento celular vascular. Biomateriales derivados de matrices extracelulares de órganos naturales (ECMs) tienen varias características que los hacen deseables para su uso en la ingeniería de tejidos, incluyendo su composición biológica natural; macro y microestructura apropiada para dotar la función fisiológica; y biocompatibilidad celular, la promoción de la adhesión celular, la migración, y la remodelación de tejido constructivo 3. Un método prometedor para producir andamios para la regeneración del tejido renal es a través de la descelularización de alogénicas o xenogénicas riñones que conservan gran parte de la compleja composición de la proteína natural de la ECM riñón 4, retener la complejidad de arquitectura inherente del órgano, y superar la dificultad asociada con bottom hasta la ingeniería de tejidos gruesos cellularized proporcionando un suministro vascular a las células en desarrollo después de andamio recelularización 5.
Descelularización de perfusión es un proceso en elque detergentes, enzimas, u otras soluciones de células de alteración se entregan de manera uniforme a través de la red vascular del órgano 6. Esta estrategia se ha establecido como un proceso eficiente para derivar andamios ECM basada en órganos acelulares como en tres dimensiones (3D), plantillas biológicos para la ingeniería de todo el órgano 6-8, como se evidencia por el desarrollo de las plantillas renales acelulares de riñones humanos desechados 9 y los riñones xenogeneicos obtenidos de grandes animales (por ejemplo, 10 cerdos, cabras 11) y las fuentes de roedores 12. En particular, el uso de modelos animales pequeños como roedores requiere menos células y medios de cultivo, lo que es especialmente útil para los estudios recelularización órgano en el que el número de células por lo general se limitan, como es el caso de los tejidos derivados de células madre. El objetivo del protocolo descelularización descrito es para producir un ECM renal acelular que se puede utilizar como un sistema de andamios 3D para la regeneración de Structur riñónES, incluyendo túbulos nefrona que se repoblaron en el presente ejemplo con las células epiteliales tubular renal cortical humano (RCTE). Hemos descrito previamente nuestra evaluación rigurosa de un protocolo óptimo basado detergente rata descelularización riñón 7, que es más rápido (aproximadamente un día) que otros métodos reportados previamente (Ross et al .- 5 días 12, Canción y col .- 4,5 días 13), y expone el órgano a una concentración considerablemente más baja (0,1%) del dodecil sulfato de sodio desnaturalizante (SDS) durante descelularización que los informes anteriores 12-15.
Un número limitado de estudios han descrito el uso de riñones de roedores para descelularización y posterior uso como un andamio 3D para la repoblación celular (revisado en otro lugar 1) 12-16. En este protocolo, ofrecemos una descripción detallada de nuestra previamente establecido, la estrategia óptima para la producción de andamios descelularización renales acelularde Sprague Dawley riñones de rata 7. El uso de biorreactores de perfusión de diseño personalizado capaces de siembra y mantenimiento de cultivo de perfusión doble 17, que recellularize los andamios con células renales acelular RCTE humanos, que repueblan constantemente el componente tubular en estas matrices descelularizados, proliferan y sobreviven en la cultura de perfusión durante más de una semana. Además, demuestran el uso del ensayo de perfusión resazurina – una, no citotóxica de bajo costo, y la evaluación metabólica no invasivo utilizado anteriormente para Estudios de citotoxicidad 17 – para proporcionar una indicación de la viabilidad celular y la proliferación dentro de los riñones recelularizado con el tiempo 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito descelularización produce constantemente un ECM riñón completamente acelular que sirve como una plantilla 3D para el cultivo de células humanas renales corticales epiteliales tubulares (tanto proximal y distal del túbulo-derivado), además de las células endoteliales vasculares 7,17. La vasculatura renal canulado sirve como el elemento clave para la entrega uniforme de los reactivos y las células de todo el andamio en un biorreactor de puesta a punto, lo que permite que los Descel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
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