Эпителиальные Репопуляции сотовый и подготовка грызунов внеклеточный матрикс строительные леса для почечной ткани развития
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Этот протокол детали поколение бесклеточной, но Биофункциональные, почечных внеклеточного матрикса (ЕСМ) лесов, которые являются полезными в качестве мелких модельных субстратов для развития органов масштабе ткани. Sprague Dawley почек крыс через канюлю путем вставки катетер в почечную артерию и перфузию серии низкой концентрации детергентов (тритон Х-100 и додецилсульфата натрия (SDS)) в течение 26 ч, чтобы получить нетронутыми, каркасы из цельного почек с интактными perfusable сосудистой, клубочки и почечных канальцев. После decellularization, почечной каркас находится внутри специально разработанный перфузии биореактора и почечной артерии катетер подключен к перфузии цепи, состоящей из: перистальтического насоса; трубки; и дополнительные зонды для рН, растворенного кислорода, и давление. После стерилизации на эшафот с надуксусной кислоты и этанола, и балансирования рН (7,4), подмости почек готовят для посева с помощью перфузии питательной среды в крупэлектронной мощности инкубатор при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Сорок миллионов почечных кортикальной трубчатые эпителиальные (РКТО) клетки инъецируют через почечную артерию, и быстро перфузии через помост под высоким потоком (25 мл / мин) и давлении (~ 230 мм рт.ст.) в течение 15 мин до снижения потока физиологического скорости (4 мл / мин). RCTE клетки, прежде всего, заполнить трубчатый ECM нишу в почечной коры, размножаются и образуют трубчатые эпителиальные структуры в течение семи дней перфузии культуры. 44 мкМ раствор ресазурина в культуральной среде перфузии через почки в течение 1 часа при средних обменов, чтобы обеспечить флуорометрического, окислительно-восстановительный основе оценки метаболической жизнеспособности клеток и пролиферации во тубулогенеза. Почек перфузии биореактора позволяет неинвазивным выборку среды для биохимического оценки, и несколько впускные отверстия позволяют альтернативный ретроградной посев через почечную вену или мочеточника. Эти протоколы могут быть использованы для recellularize каркасов в почках сразнообразие типов клеток, в том числе сосудистого эндотелия, трубчатого эпителия и стромальных фибробластов, для быстрой оценки в этой системе.
Introduction
Как число пациентов, страдающих от терминальной стадии почечной недостаточности продолжает расти, есть тяжелые и нарастающий дефицит в ряде почек донор для трансплантации. Неспособность удовлетворить спрос в постоянно растущего числа кандидатов ждать список для трансплантации почек побудило исследования в почки органов инженерии с конечной целью разработки индивидуальных, имплантируемые трансплантатов почек по требованию 1,2. Строительство функционирование почек ткани из собственных клеток пациента устранит необходимость пожизненного иммунитета, уменьшения количества времени пациенты тратят на диализе в ожидании пересадки почки, и расширить трансплантации жизненно большему числу пациентов с хронической болезнью почек.
Первый шаг к биоинженерии ткани почек, используя клетки пациента, полученных заключается в разработке эшафот, который служит в качестве субстрата для поддержки почечной паренхимы (например, трубчатые epitheLiaL), стромы фибробластов, и рост клеток сосудов. Биоматериала леса, полученные из природных органов внеклеточного матрикса (ЕСМ) имеют несколько особенностей, которые делают их желательными для использования в тканевой инженерии, в том числе их естественного биологического состава; соответствующий макро- и микроструктура, чтобы наделить физиологическую функцию; и сотовый биосовместимость, содействие клеточную адгезию, миграцию и конструктивный ткани ремоделирования 3. Перспективным методом для получения каркасов для регенерации тканей почек через decellularization аллогенных или ксеногенных почек, сохраняющих большую часть сложных природных белков состава ECM почек 4, сохранить присущую архитектурный запутанность органа, и преодолеть трудности, связанные с снизу- до машиностроения толстых тканей cellularized путем предоставления кровоснабжение в развивающихся клеток после лесов recellularization 5.
Перфузии decellularization это процесс, вкоторые моющие средства, ферменты или другие растворы клеточных разрушающие равномерно подается через сосудистую сеть органа 6. Эта стратегия была создана в качестве эффективного процесса для получения бесклеточные органов на основе ECM подмости, как трехмерная (3D), биологических шаблонов для целого органа техники 6-8, о чем свидетельствует развитие бесклеточными почечных шаблонов из выброшенных человеческих почек 9 и ксеногенные почки, полученные от большого животного (например свиньи 10, козьим 11) и источников грызунов 12. В частности, использование малых животных моделях, таких как грызуны требуется меньше клеток и питательных сред, что особенно полезно для органов recellularization исследований, в которых число клеток, как правило, ограничены, как в случае с клеточными полученных тканей стволовых. Целью описываемого протокола decellularization является создание бесклеточной почечной ЕСМ, который можно использовать в качестве системы 3D лесов для регенерации почек СтруктурES, в том числе нефрона канальцев, которые заполненного в данном примере с человеком почек кортикального трубчатые эпителиальные (РКТО) клеток. Мы ранее описано наше строгую оценку оптимального, моющих средств на основе decellularization почек крыс протокола 7, который является более быстрым (примерно один день), чем другие методы, ранее сообщалось (Росс и др .- 5 дней 12, Песня др .- 4,5 дней 13), и выставляет орган в значительно более низкой концентрации (0,1%) в додецилсульфата денатуранта натрия (ДСН) при decellularization чем предыдущие доклады 12-15.
Ограниченное число исследований, посвященных использованию грызунов почек для decellularization и последующего использования в качестве 3D эшафот для сотовых заселения (обзор других 1) 12-16. В этом протоколе, мы предоставляем подробное описание нашего установленной ранее, оптимальной стратегии decellularization для производства каркасов бесклеточные почкахот Спрэг Dawley крыс почек 7. Использование специально разработанных биореакторов, способных перфузии двойного посева и обслуживания перфузии культуры 17, мы recellularize бесклеточной каркасов в почках с человека RCTE клеток, которые постоянно заселить трубчатый компонент в этих decellularized матриц, размножаются, и выжить в перфузии культуры в течение недели. Кроме того, мы демонстрируем нашу использование ресазурин перфузии анализа – недорогой, не-цитотоксических и неинвазивной оценки метаболической ранее используемой на цитотоксичность изучает 17 – для индикации жизнеспособности и пролиферации клеток в пределах recellularized почки в течение времени 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол decellularization последовательно производит полностью бесклеточной ECM почек, который служит в качестве шаблона для 3D культуры человеческих почечных корковых трубчатых эпителиальных клеток (как проксимальных и дистальных канальцев происхождения), в дополнение к эндотели?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
