الظهارية إعادة تعمير خلية وإعداد القوارض خارج الخلية مصفوفة السقالات للتنمية نسيج الكلى
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
هذا البروتوكول تفاصيل توليد اخلوي، بعد biofunctional، الكلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالات التي هي مفيدة بمثابة ركائز نموذجا مصغرا للتنمية أنسجة الجهاز النطاق. ومقنى الكلى الفئران سبراغ داولي عن طريق إدخال قسطرة في الشريان الكلوي ومع perfused سلسلة من المنظفات المنخفض التركيز (تريتون X-100 و سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS)) أكثر من 26 ساعة لاشتقاق سليمة، السقالات كامل الكلى مع سليمة الأوعية الدموية perfusable، الكبيبات، والأنابيب الكلوية. بعد decellularization، يتم وضع سقالة الكلى داخل سفينة نضح مفاعل حيوي مصمم خصيصا، وتوصيل الشريان الكلوي القثطار إلى الدائرة نضح وتتألف من: مضخة تحوي؛ أنابيب. وتحقيقات اختياري للأس الهيدروجيني، الأكسجين الذائب، والضغط. بعد تعقيم السقالة مع حمض البيروكسي والإيثانول، وموازنة درجة الحموضة (7.4)، ويتم إعداد السقالة الكلى لبذر عبر نضح من مستنبت داخل تأحافظت حاضنة القدرات ه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. يتم حقن أربعين مليون الظهارية أنبوبي القشرية (RCTE) خلايا الكلى من خلال الشريان الكلوي، وبسرعة perfused لمن خلال منصة الاعدام تحت تدفق عالية (25 مل / دقيقة) وضغط (~ 230 مم زئبق) لمدة 15 دقيقة قبل الحد من تدفق إلى معدل الفسيولوجية (4 مل / دقيقة). خلايا RCTE تعبئة في المقام الأول على ECM المتخصصة أنبوبي داخل القشرة الكلوية، تتكاثر، وتشكيل الهياكل الظهارية الأنبوبية على مدى سبعة أيام الثقافة نضح. وperfused لحل ريسازورين 44 ميكرومتر في مستنبت من خلال الكلى لمدة 1 ساعة خلال تبادل المتوسطة لتوفير فلوروميتريك، على أساس الأكسدة تقييم التمثيل الغذائي للبقاء الخلية والانتشار خلال tubulogenesis. مفاعل حيوي نضح الكلى يسمح أخذ العينات غير الغازية المتوسطة لتقييم والكيمياء الحيوية، والموانئ مدخل متعددة تسمح البذر الوراء بديل عن طريق الوريد الكلوي أو الحالب. هذه البروتوكولات يمكن استخدامها لrecellularize السقالات الكلى معمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك بطانة الأوعية الدموية، الظهارية أنبوبي، والخلايا الليفية اللحمية، لتقييم السريع داخل هذا النظام.
Introduction
كما لا يزال عدد من المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي في نهاية المرحلة إلى زيادة، وهناك نقص حاد ومتزايد في عدد من الكلى المانحة المتاحة للزرع. عدم القدرة على تلبية الطلب من عدد متزايد باستمرار من المرشحين المدرجة في الانتظار لزرع الكلى دفعت الأبحاث في مجال الهندسة الجهاز الكلى مع الهدف النهائي المتمثل بتطوير حسب الطلب، الطعوم الكلى زرع عند الطلب 1،2. سوف تعمل بناء أنسجة الكلى من خلايا المريض نفسه القضاء على الحاجة إلى تثبيط المناعة مدى الحياة، وتقلل من كمية الوقت المرضى يقضون على غسيل الكلى في انتظار عملية زرع الكلى، وتوسيع زرع المنقذة للحياة إلى مزيد من المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن.
الخطوة الأولى نحو الهندسة الحيوية نسيج الكلى باستخدام الخلايا المشتقة من المريض هو تطوير سقالة التي هي بمثابة الركيزة الداعمة لحمة الكلوي (على سبيل المثال epithe أنبوبيlial)، الخلايا الليفية سدى، ونمو الخلايا في الأوعية الدموية. السقالات مادة بيولوجية مستمدة من هيئة الطبيعي مصفوفات خارج الخلية (موبينيل) لديها العديد من الخصائص التي تجعلها مرغوبة للاستخدام في هندسة الأنسجة، بما في ذلك تكوين البيولوجي الطبيعي فيها؛ الاقتصاد الكلي والمجهرية مناسبا لمنح وظيفة فسيولوجية. وتوافق مع الحياة الخلوية، وتعزيز التصاق الخلية، والهجرة، والأنسجة بناءة إعادة عرض 3. وهناك طريقة واعدة لإنتاج السقالات لتجديد أنسجة الكلى من خلال decellularization من خيفي أو xenogeneic الكلى التي تحافظ على الكثير من التعقيد تكوين البروتين الطبيعي للECM الكلى 4، الإبقاء على تعقيد المعماري الأصيل للجهاز، والتغلب على الصعوبات المرتبطة من الأسفل يصل هندسة الأنسجة cellularized سميكة من خلال توفير إمدادات الأوعية الدموية إلى خلايا النامية بعد سقالة recellularization 5.
نضح decellularization هو عمليةيتم تسليم والمنظفات، والإنزيمات، أو غيرها من الحلول تعطيل الخلايا بشكل موحد من خلال شبكة الأوعية الدموية للجهاز 6. وقد أنشئت هذه الاستراتيجية باعتبارها عملية فعالة لاستخلاص ديكي السقالات ECM القائم على الجهاز كما ثلاثي الأبعاد (3D)، والقوالب البيولوجية للهندسة كامل الجهاز 6-8، كما يتضح من خلال تطوير نماذج الكلى ديكي من كلى الانسان التخلص منها 9 والكليتين xenogeneic تم الحصول عليها من واسع الحيواني (مثل الخنزير 10، الماعز 11) ومصادر القوارض 12. على وجه الخصوص، واستخدام النماذج الحيوانية الصغيرة مثل القوارض يتطلب أقل الخلايا وسائل الإعلام والثقافة، وهي مفيدة بشكل خاص للدراسات recellularization الجهاز الذي أعداد الخلايا وعادة ما تكون محدودة، كما هو الحال مع الأنسجة المشتقة من الخلايا الجذعية. والهدف من هذا البروتوكول decellularization وصفها هو إنتاج ECM الكلوي لا خلوي التي يمكن استخدامها كنظام سقالة 3D لتجديد متطوره الكلىوفاق، بما في ذلك الأنابيب كليون التي يتم إسكانها في المثال الحالي مع الإنسان الكلوي الظهارية أنبوبي القشرية (RCTE) الخلايا. وصفنا سابقا تقييم دقيق لدينا لالأمثل، القائم على بروتوكول المنظفات الفئران الكلى decellularization 7، التي هي أكثر سريعة (يوم واحد تقريبا) من طرق أخرى ذكرت سابقا (روس آخرون .- 5 أيام 12، الأغنية وآخرون .- 4.5 أيام 13)، ويعرض الجهاز إلى تركيز أقل من ذلك بكثير (0.1٪) من كبريتات الصوديوم دوديسيل ممسخ (SDS) خلال decellularization من التقارير السابقة 12-15.
وقد وصف عدد محدود من الدراسات استخدام الكلى القوارض لdecellularization واستخدامها فيما بعد بمثابة سقالة 3D لإعادة تعمير الخلوية (إعادة النظر في أماكن أخرى 1) 12-16. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وصفا مفصلا لالمحددة مسبقا، واستراتيجية decellularization المثلى لدينا لإنتاج السقالات الكلى ديكيمن سبراج داولي الكلى الفئران 7. باستخدام مصمم خصيصا المفاعلات الحيوية نضح قادرة على المزدوجة البذر وصيانة نضح الثقافة 17، ونحن recellularize السقالات الكلى ديكي مع الخلايا RCTE الإنسان، الذي اعد اسكان على الدوام عنصر أنبوبي في هذه المصفوفات decellularized، تتكاثر، والبقاء على قيد الحياة في الثقافة نضح لأكثر من أسبوع. نظهر أيضا استخدامنا للمقايسة ريسازورين نضح – غير مكلفة وغير السامة للخلايا، وتقييم الأيضي غير الغازية المستخدمة سابقا من أجل سمية الخلايا يدرس 17 – لتوفير مؤشرا على بقاء الخلية والانتشار داخل الكلى recellularized مع مرور الوقت 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول decellularization وصف ينتج باستمرار ECM الكلى لا خلوي تماما أن يخدم كنموذج 3D للثقافة الخلايا البشرية الكلى القشرية أنبوبي الظهارية (على حد سواء القريبة والبعيدة المستمدة من أنبوب صغير)، بالإضافة إلى خلايا بطانة الأوعية الدموية 7،17. يخدم الأوعية الدموية الكلوية…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
