Epithelial cellerepopulationskilde og Udarbejdelse af Gnaver ekstracellulær matrix Stilladser for Renal Tissue Udvikling

Summary

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Abstract

Denne protokol beskriver genereringen af ​​acellulær, endnu biofunktionelle, renale ekstracellulær matrix (ECM) stilladser, der er egnede som små modelsubstrater for orgel-skala vævsudvikling. Sprague Dawley rottenyrer kanyle ved at indsætte et kateter i den renale arterie og perfunderet med en række lav koncentration detergenter (Triton X-100 og natriumdodecylsulfat (SDS)) i løbet af 26 timer til at udlede intakte, hel-nyre stilladser med intakt perfusable vaskulatur, glomeruli og renale tubuli. Efter decellularization, er den renale scaffold anbragt i en specialdesignet perfusionsbioreaktor fartøj, og den kateter nyrearterie er forbundet til et perfusionskredsløb bestående af: en peristaltisk pumpe; rørledningen; og valgfrie prober for pH, opløst oxygen og tryk. Efter sterilisering stilladset med pereddikesyre og ethanol og balancering af pH (7,4), er nyrerne scaffold forberedt til såning via perfusion af dyrkningsmedium i et large-kapacitet inkubator holdt ved 37 ° C og 5% _CO2. Fyrre millioner renale kortikal rørformede epiteliale (RCTE) celler injiceres gennem den renale arterie, og hurtigt perfunderet gennem stilladset under højt flow (25 ml / min) og tryk (~ 230 mmHg) i 15 min før reducere strømmen til en fysiologisk sats (4 ml / min). RCTE celler primært befolker rørformede ECM niche inden for den renale cortex, formere, og danner rørformede epitel strukturer over syv dage af perfusion kultur. En 44 uM resazurin løsning i dyrkningsmedium perfuseres gennem nyrerne i 1 time under mellemstore udvekslinger til at give en fluorometrisk, redox-baserede metabolisk vurdering af levedygtighed og proliferation celle under tubulogenesis. Nyrerne perfusionsbioreaktor tillader ikke-invasiv prøveudtagning af medium til biokemisk evaluering, og flere indløbsåbninger tillade alternative retrograd podning gennem den renale vene eller ureter. Disse protokoller kan anvendes til at recellularize nyre stilladser med enrække celletyper, herunder vaskulær endotel, rørformede epitel, og stromale fibroblaster, til hurtig evaluering af dette system.

Introduction

Da antallet af patienter med slutstadiet nyresvigt fortsætter med at stige, er der en alvorlig og voksende mangel i antallet af donor nyrer rådighed til transplantation. Den manglende evne til at imødekomme efterspørgslen fra et konstant stigende antal kandidater Vent-børsnoterede for nyretransplantation har bedt forskning i nyre orgel ingeniør med det ultimative mål at udvikle skræddersyede, implantable nyre transplantater på efterspørgslen ^1,2. Opbygning fungerende nyre væv fra en patients egne celler vil eliminere behovet for livslang immunosuppression, mindske mængden af ​​tid patienter tilbringer i dialyse venter på en nyretransplantation, og udvide livreddende transplantation til flere patienter med kronisk nyresygdom.

Det første skridt mod Bioengineering en nyre vævet med patient-afledte celler er at udvikle et stillads, der fungerer som en støttende substrat for renal parenkym (f.eks rørformet epitheLiAl), stroma fibroblast og vaskulær cellevækst. Biomateriale stilladser afledt fra naturlige organ ekstracellulære matricer (ECMS) har flere egenskaber, der gør dem ønskelige til anvendelse i vævsmanipulering, herunder deres naturlige biologiske sammensætning; passende makro- og mikrostruktur at udstyre fysiologiske funktion; og cellulære biokompatibilitet, fremme celleadhæsion, migration og konstruktiv væv remodellering ^3. En lovende fremgangsmåde til fremstilling af stilladser for renal vævsregenerering er gennem decellularization af allogene eller xenogene nyrer, der bevarer en stor del af den komplekse naturlige proteinsammensætning i nyrerne ECM ^4, bevarer den iboende arkitektoniske forviklinger af organet, og overvinde vanskelighederne forbundet med bottom- up engineering af tykke cellularized væv ved at give en vaskulær forsyning til udviklingslande celler efter stillads recellularization ^5.

Perfusion decellularization er en proces,som detergenter, enzymer eller andre cellebaserede forstyrre opløsninger ensartet leveres gennem det vaskulære netværk af organet ^6. Er blevet etableret denne strategi som en effektiv proces til at udlede acellulære organ-baserede ECM scaffolds som tredimensionale (3D), biologiske skabeloner til hel-organmanipulation ^6-8, som det fremgår af udviklingen af acellulære renale skabeloner fra kasserede humane nyrer ⁹ og xenogene nyrer opnået fra store dyr (f.eks gris ^10, ged ¹¹⁾ og gnaver kilder ^12. Især anvendelsen af ​​små dyremodeller såsom gnavere kræver færre celler og dyrkningsmedier, der er specielt nyttigt for orgel recellularization undersøgelser, hvor celleantal er normalt begrænset, som det er tilfældet med stamcelle-afledte væv. Målet med den beskrevne decellularization protokollen er at fremstille en acellulær renal ECM, der kan bruges som et 3D-stilladssystem til regenerering af nyre struktues, herunder nephron tubuli, der er repopulerede i det foreliggende eksempel med human renal cortical rørformede epitelceller (RCTE) celler. Vi tidligere beskrevet vores strenge evaluering af en optimal, detergent-baserede rottenyre decellularization protokol ^7, som er hurtigere (ca. en dag) end andre metoder, der tidligere er rapporteret (Ross et al .- 5 dage ^12, Song et al .- 4,5 dage ^13), og udsætter organet til en væsentligt lavere koncentration (0,1%) af denatureringsmidlet natriumdodecylsulfat (SDS) under decellularization end tidligere rapporter ^12-15.

Et begrænset antal undersøgelser har beskrevet anvendelsen af gnaver nyrer for decellularization og efterfølgende anvendelse som en 3D-stillads for cellulær repopulation (peer andetsteds ^{1) 12-16.} I denne protokol, giver vi en detaljeret beskrivelse af vores tidligere konstaterede optimal decellularization strategi til fremstilling acellulære nyre stilladserfra Sprague Dawley rottenyrer ^7. Anvendelse af specialdesignede perfusion bioreaktorer i stand til dual såning og vedligeholdelse perfusion kultur ^17, vi recellularize de acellulære nyre stilladser med humane RCTE celler, som konsekvent genbefolke rørformede komponent i disse decellulariseret matricer, prolifererer og overleve i perfusion kultur i over en uge. Vi viser yderligere vores brug af resazurin perfusion assay – en billig, ikke-cytotoksisk, og ikke-invasiv metabolisk vurdering tidligere anvendt til Cytotoksicitetsstudier ¹⁷ – at tilvejebringe en indikation af cellelevedygtighed og proliferation inden for de recellularized nyrerne over tid ^7.

Protocol

ETIK ERKLÆRING: Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i henhold til retningslinjer godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Northwestern University. 1. Nyre Decellularization Forbered decellularization løsninger. Forbered følgende mængder af reagenser for hver nyre skal decellulariserede, plus en ekstra volumen (fx for 4 nyrer, forberede 5.000 ml Triton X-100 for trin 1.1.3.): Forbered 500 ml omvendt osmose vand (ROH 2 O). Be…

Representative Results

Nyrer sekventielt perfunderet med vand og fortyndet detergentopløsninger (1% Triton X-100, 0,1% SDS) ifølge en tidligere konstaterede optimal decellularization protokollen (se figur 1A, B) 7, bliver gradvist mere gennemsigtig over en 26 timers periode, som vist i figur 2A. Den resulterende acellulære nyre stillads er blottet for celler og bibeholder en sammenhængende renal ECM understøttet af en intakt renal kapsel, som er ubeskadiget efter perfusion protokol. Som den en…

Discussion

Den beskrevne decellularization protokol konsekvent frembringer en helt acellulær nyre ECM, der fungerer som en 3D-skabelon til dyrkning af humane renale corticale tubulære epitelceller (både proximale og distale tubulus-afledt), i tillæg til vaskulære endotelceller ^7,17. Den kanyle renal vaskulatur fungerer som det centrale element for ensartet levering af reagenser og celler i hele stilladset i en bioreaktor set-up, således at de perfusion decellularization, celle seeding, langsigtet perfusion kultur,…

Materials

Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO	VWR	M143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O	Sigma-Aldrich	05030
Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT)	Sigma-Aldrich	77240	Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanol	VWR	V1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces	Sigma-Aldrich	SL2	For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 media	Life Technologies	11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech	Corning	35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin	Corning	30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol Red	Life Technologies	12605-028	Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%)	Life Technologies	15250-061
Resazurin sodium salt	Sigma-Aldrich	R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC	Cole-Parmer	EW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads.	Cole-Parmer	EW-07519-70	Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head.	Cole-Parmer	EW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serrated	VWR	82027-438
*Kidney perfusion bioreactor	WilMad Labglass	*Custom designs	Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca)	BD Biosciences	381412	Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25'	Cole-Parmer	HV-06508-14	Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack	Cole-Parmer	HV-06411-62	Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft.	Cole-Parmer	HV-96410-14	Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD	VWR	89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences	VWR	28143-558	Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk	Cole-Parmer	T-45505-11	Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk	Cole-Parmer	EW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-22	Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk	Cole-Parmer	EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs	Careforde Healthcare	10254821	Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip.	BD Biosciences	309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish	BD Biosciences	353001	Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.