Épithéliale repeuplement cellulaire et préparation des rongeurs matrice extracellulaire échafaudages pour le développement de tissu rénal
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Ce protocole détaille la génération de acellulaire, encore, des échafaudages biofonctionnels rénales matrice extracellulaire (MEC) qui sont utiles comme substrats modèles à petite échelle pour le développement du tissu organe échelle. Reins de rats Sprague Dawley sont canulées par l'insertion d'un cathéter dans l'artère rénale et perfuses avec une série de détergents à faible concentration (Triton X-100 et du dodécylsulfate de sodium (SDS)) de plus de 26 heures pour obtenir intactes, des échafaudages entier rénaux avec intact vascularisation perfusable, glomérules et les tubules rénaux. À la suite de la décellularisation, l'échafaudage rénale est placé dans un récipient bioréacteur à perfusion conçu sur mesure, et cathétérisé l'artère rénale est connecté à un circuit de perfusion comprenant: une pompe péristaltique; tube; et en option des sondes pour le pH, l'oxygène dissous et la pression. Après stérilisation du échafaud avec de l'acide peracétique et d'éthanol, et en équilibrant le pH (7,4), l'échafaudage de rein est préparée pour l'ensemencement par perfusion de milieu de culture dans un large-capacité incubateur maintenu à 37 ° C et 5% de CO 2. Quarante millions épithéliales tubulaire cortical (RCTE) les cellules rénales sont injectés dans l'artère rénale, rapidement et perfuses à travers l'échafaudage sous fort débit (25 ml / min) et la pression (~ 230 mmHg) pendant 15 min avant de réduire le débit à un taux physiologique (4 ml / min). Cellules RCTE peuplent principalement le créneau ECM tubulaire dans le cortex rénal, prolifèrent, et forment des structures épithéliales tubulaires plus de sept jours de culture de perfusion. Une solution de résazurine 44 pM dans du milieu de culture est perfusé à travers le rein pendant 1 heure au cours d'échanges moyen pour fournir une évaluation sur la base du métabolisme redox fluorométrique de la viabilité cellulaire et la prolifération pendant tubulogenèse. Le bioréacteur de perfusion rénale permet échantillonnage non invasive pour l'évaluation de milieu biochimique, et de multiples orifices d'entrée permet l'ensemencement rétrograde alternatif à travers la veine rénale ou de l'uretère. Ces protocoles peuvent être utilisés pour recellularize échafaudages de rein avec unegrande variété de types cellulaires, y compris l'endothélium vasculaire, l'épithélium tubulaire, et les fibroblastes du stroma, pour une évaluation rapide au sein de ce système.
Introduction
Comme le nombre de patients souffrant d'insuffisance rénale terminale continue d'augmenter, il ya une pénurie grave et croissante du nombre de reins de donneurs disponibles pour la transplantation. L'incapacité à répondre à la demande d'un nombre croissant continuellement des candidats en liste d'attente pour une transplantation rénale a incité la recherche en ingénierie d'organe de rein avec le but ultime de développement personnalisé, des greffes de rein implantables sur demande 1,2. Fonctionnement tissu rénal partir des propres cellules d'un patient de construction permettrait d'éliminer la nécessité d'immunosuppression à vie, diminuer la quantité de temps que les patients passent à la dialyse en attente d'une greffe de rein, et d'étendre la transplantation de sauver la vie à plus de patients atteints de maladie rénale chronique.
La première étape vers la bioingénierie un tissu de rein en utilisant des cellules provenant de patients est de développer un échafaudage qui sert de substrat favorable pour parenchyme rénal (par exemple épithélium tubulaireLiAl), des fibroblastes du stroma, et la croissance des cellules vasculaires. Échafaudages de biomatériaux dérivés de orgue naturelle matrices extracellulaires (ECM) ont plusieurs caractéristiques qui les rendent souhaitables pour une utilisation dans l'ingénierie tissulaire, y compris leur composition biologique naturelle; macro et microstructure appropriée pour doter la fonction physiologique; et la biocompatibilité cellulaire, favoriser l'adhésion cellulaire, la migration, et le tissu constructive remodelage 3. Une méthode prometteuse pour produire des échafaudages pour la régénération tissulaire rénale est par décellularisation de allogéniques ou xénogéniques reins qui préservent une grande partie de la composition de protéine naturelle complexe du rein ECM 4, conserver la complexité architecturale inhérente de l'organe, et de surmonter la difficulté associée à ascendante jusqu'à l'ingénierie des tissus épais cellularisées en fournissant un apport vasculaire de cellules en développement après échafaudage recellularization 5.
Perfusion décellularisation est un processus dansces détergents, des enzymes, ou d'autres solutions perturber cellules sont uniformément livrés à travers le réseau vasculaire de l'organe 6. Cette stratégie a été établie comme un processus efficace pour dériver acellulaire échafaudages ECM basé organes, comme en trois dimensions (3D), modèles biologiques pour l'ingénierie entier organe 6-8, comme en témoigne le développement de modèles rénales acellulaire à partir de reins humains jetés 9 et les reins xénogéniques obtenus à partir de grand animal (par exemple 10 cochon, la chèvre 11) et sources de rongeurs 12. En particulier, l'utilisation de petits modèles animaux comme les rongeurs nécessite moins de cellules et les milieux de culture, ce qui est particulièrement utile pour les études de recellularization de l'organe dans lequel le nombre de cellules sont habituellement limitées, comme cela est le cas avec les tissus dérivés de cellules souches. Le but du protocole de décellularisation est décrit pour produire un ECM rénale acellulaire qui peut être utilisé comme un système d'échafaudage 3D pour la régénération du rein structures, y compris les tubules du néphron qui sont repeuplé dans le présent exemple avec épithéliales tubulaire du cortex rénal humain (RCTE) cellules. Nous avons décrit précédemment notre évaluation rigoureuse d'un optimale, à base de détergent protocole de rein de rat de décellularisation 7, ce qui est plus rapide (environ un jour) que les autres méthodes précédemment rapportés (Ross et al .- 5 jours 12, Song et al .- 4,5 jours 13), et expose l'organe à une concentration beaucoup plus faible (0,1%), du sulfate de dodécyle de sodium dénaturant (SDS) au cours de la décellularisation de rapports antérieurs 12-15.
Un nombre limité d'études ont décrit l'utilisation de reins de rongeurs pour décellularisation et l'utilisation ultérieure comme un échafaudage 3D pour le repeuplement cellulaire (revue ailleurs 1) 12-16. Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée de notre établi précédemment, la stratégie de décellularisation optimale pour produire des échafaudages rénaux acellulairede Sprague-Dawley reins de rats 7. Utilisation de bioréacteurs de perfusion conçu sur mesure capables de double ensemencement et la maintenance perfusion culture 17, nous recellularize les échafaudages rénaux acellulaires avec des cellules de RCTE humaines, qui repeupler toujours l'élément tubulaire dans ces matrices décellularisés, prolifèrent, et survivent dans la culture de perfusion pendant une semaine. Nous démontrons en outre notre utilisation de la résazurine dosage de perfusion – une, non cytotoxiques peu coûteux, et l'évaluation non invasive métabolique précédemment utilisé pour la cytotoxicité étudie 17 – pour fournir une indication de la viabilité cellulaire et de prolifération dans les reins au cours du temps recellularized 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole de décellularisation décrit un produit toujours ECM rénale complètement acellulaire qui sert de modèle 3D pour la culture de cellules humaines épithéliales tubulaires rénales corticales (à la fois proximale et distale tubules dérivés), en plus des cellules endotheliales vasculaires 7,17. Le système vasculaire rénale canule sert l'élément clé pour la livraison uniforme des réactifs et des cellules à travers l'échafaud dans un bioréacteur mis en place, permettant ainsi a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
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