Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
פרוטוקול זה מפרט את הדור של acellular, עדיין פיגומי biofunctional, כליות מטריצה תאית (ECM), כי הם שימושיים כמו מצעי דגם בקנה מידה קטנה לפיתוח רקמות איבר בקנה מידה. כליות עכברוש ספראג Dawley הם cannulated ידי החדרת צנתר לעורק הכליה וperfused עם סדרה של חומרי ניקוי נמוך ריכוז (Triton X-100 וסולפט dodecyl נתרן (SDS)) מעל 26 שעות כדי להפיק פיגומים עם שלם ללא פגע, כל-הכליה כלי דם perfusable, glomeruli, וtubules כליות. בעקבות decellularization, פיגום הכליות ממוקם בתוך כלי bioreactor זלוף אישית מעוצב, ועורק הכליה צינתור מחובר למעגל זלוף הכולל: משאבת peristaltic; צינורות; ובדיקות אופציונליות עבור pH, חמצן מומס, ולחץ. לאחר חיטוי הפיגום עם חומצת peracetic ואתנול, ואיזון רמת החומציות (7.4), פיגום הכליה מוכן לזריעה באמצעות טפטוף של מדיום התרבות בתוך largחממת דואר קיבולת נשמרה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. ארבעים מיליון אפיתל צינורי קליפת המוח תאי כליה (RCTE) מוזרקים דרך עורק הכליה, ומהירות perfused דרך הפיגום תחת זרימה גבוהה (25 מיליליטר / דקה) ולחץ (~ 230 מ"מ כספית) במשך 15 דקות לפני הפחתת הזרימה לשיעור פיסיולוגי (4 מיליליטר / דקה). תאי RCTE בעיקר לאכלס את הנישה ECM צינור בתוך קליפת הכליה, להתרבות, וליצור מבני אפיתל צינורי בשבעה ימים של תרבות זלוף. פתרון resazurin 44 מיקרומטר במדיום תרבות perfused דרך הכליות עבור שעה 1 בחילופים בינוניים לספק הערכת fluorometric, המבוסס על חיזור חילוף חומרים של כדאיות תא ושגשוג במהלך tubulogenesis. Bioreactor זלוף הכליות מאפשר דגימה לא פולשנית של מדיום להערכה ביוכימי, ויציאות כניסה מרובות לאפשר זריעת מדרדר חלופית דרך הווריד או השופכן כליות. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לrecellularize פיגומי כליות עםמגוון רחב של סוגי תאים, כולל אנדותל כלי דם, אפיתל צינורי, וfibroblasts סטרומה, להערכה מהירה בתוך מערכת זו.
Introduction
ככל שמספר חולים הסובלים מאי ספיקת כליות סופנית ממשיך להגדיל, יש מחסור חמור וגובר במספר כליות תורם זמינים להשתלה. חוסר היכולת לעמוד בביקוש של מספר עולה הרף של מועמדים ברשימת הממתינים להשתלת כליה גרמה מחקר בהנדסת איבר כליות עם המטרה הסופית של פיתוח מותאם אישית, שתלי כליה מושתלים בביקוש 1,2. בניית רקמות כליה מתפקדות מהתאים של חולה היה מבטלת את הצורך בדיכוי חיסוני לכל החיים, להקטין את כמות זמן חולים מוציאים על דיאליזה מחכים להשתלת כליה, ולהרחיב את ההשתלה להצלת חיים ליותר חולים עם מחלת כליות כרונית.
הצעד הראשון לקראת ביו-הנדסת רקמות כליה באמצעות תאים שמקורם בחולה הוא לפתח פיגום שמשמש כמצע תומך לparenchyma כליות (למשל epithe צינוריליאל), פיברובלסטים סטרומה, וצמיחת תאי כלי דם. יש לי פיגומים ביולוגי המופקים ממטריצות איבר טבעי תאיים (ECMS) כמה מאפיינים שהופכים אותם רצויים לשימוש בהנדסת רקמות, כולל ההרכב הביולוגי הטבעי שלהם; מאקרו ומייקרו המתאימים להעניק תפקוד פיסיולוגי; והתאמה ביולוגית סלולרית, קידום הידבקות תא, הגירה, ורקמה בונה שיפוץ 3. שיטה מבטיחה לייצר פיגומים לשחזור רקמות כליה היא באמצעות decellularization של כליות אלוגנאית או xenogeneic שלשמר הרבה של הרכב החלבון טבעי המורכב של ECM הכליות 4, לשמר את המורכבות אדריכליות הגלומות של האיבר, ולהתגבר על הקושי קשור לישבנים עד הנדסת רקמות cellularized העבות על ידי מתן אספקת דם לתאי פיתוח לאחר recellularization הפיגום 5.
decellularization זלוף הוא תהליך בחומרי ניקוי, אנזימים, או פתרונות הפוגעים בתאים אחרים שמועברים באופן אחיד דרך רשת כלי הדם של האיבר 6. אסטרטגיה זו כבר נקבעה כתהליך יעיל להפיק פיגומי ECM מבוסס איבר acellular כשלושה ממדים (3D), תבניות ביולוגיות להנדסה כל-איבר 6-8, כפי שמעיד על ההתפתחות של תבניות כליות acellular מכליות אדם מושלכות 9 וכליות xenogeneic התקבלו מבעלי החיים גדולים (למשל חזיר 10, עז 11) ומקורות 12 מכרסמים. בפרט, השימוש במודלים של בעלי חיים קטנים כגון מכרסמים דורשים פחות תאים ותקשורת ותרבות, שהוא מועיל במיוחד ללימודי recellularization האיבר שבו מספרים סלולריים מוגבלים בדרך כלל, כמו במקרה עם רקמות המופקים מתאי גזע. המטרה של פרוטוקול decellularization המתואר היא לייצר ECM כליות acellular שיכול לשמש כמערכת פיגומי 3D להתחדשות של structur הכליותes, כולל tubules נפרון שאוכלסו מחדש בדוגמא הנוכחית עם אפיתל צינורי קליפת המוח כליות אדם תאים (RCTE). אנחנו שתוארו קודם לכן ההערכה הקפדני שלנו של פרוטוקול אופטימלי, המבוסס על חומרי ניקוי decellularization כליות עכברוש 7, שהוא מהיר יותר (יום בערך) יותר מאשר בשיטות אחרות שדווחו בעבר (רוס ואח '.- 5 ימים 12, שיר ואח' .- 4.5 ימים 13), וחושף את האיבר לריכוז נמוך משמעותי (0.1%) של סולפט dodecyl נתרן denaturant (SDS) במהלך decellularization מדיווחים קודמים 12-15.
מספר מצומצם של מחקרים שתיארו את השימוש בכליות מכרסמי decellularization והשימוש הבא כפיגום 3D לאכלוס סלולארי (ביקורת במקומות אחרים 1) 12-16. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של האסטרטגיה שלנו הוקמה בעבר, האופטימלית decellularization לייצור פיגומי כליות acellularמכליות עכברוש ספראג Dawley 7. באמצעות bioreactors זלוף אישית מעוצבת מסוגל תרבות זלוף הכפולה זריעה ותחזוקת 17, אנחנו recellularize פיגומי כליות acellular עם תאי RCTE אנושיים, אשר באופן עקבי לאכלס מחדש את רכיב צינורי במטריצות decellularized אלה, להתרבות, ולשרוד בתרבות זלוף במשך יותר משבוע. בנוסף, אנו מראים השימוש של assay זלוף resazurin – שאינן רעילה לתאים זולים, וההערכה מטבולית לא פולשנית שימש בעבר לרעיל לומד 17 – כדי לספק אינדיקציה לכדאיויות תא ושגשוג בתוך כליות recellularized לאורך זמן 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול decellularization תאר מייצר באופן עקבי ECM כליות acellular לחלוטין המשמש כתבנית 3D לתרבות של תאים אנושיים כליה קליפת המוח צינורי אפיתל (שני הפרוקסימלי ודיסטלי נגזר אבובית), בנוסף לתאי האנדותל של כלי דם 7,17. כלי דם כליות cannulated משמש כתכונה המרכזית למסירה אחידה של חומרים …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
