उपकला सेल repopulation और गुर्दे ऊतकों के विकास के लिए कृंतक बाह्य मैट्रिक्स scaffolds के तैयारी
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
इस प्रोटोकॉल अकोशिकीय, अंग-पैमाने ऊतक विकास के लिए छोटे पैमाने पर मॉडल substrates के रूप में उपयोगी होते हैं कि अभी तक biofunctional, गुर्दे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) scaffolds के पीढ़ी का विवरण है। Sprague Dawley चूहे गुर्दे बरकरार साथ बरकरार, पूरे गुर्दे scaffolds के प्राप्त करने के लिए 26 घंटे से अधिक गुर्दे धमनी में एक कैथेटर डालने से cannulated और कम एकाग्रता डिटर्जेंट (ट्राइटन X-100 और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस)) की एक श्रृंखला के साथ perfused कर रहे हैं perfusable वाहिका, ग्लोमेरुली, और गुर्दे की नलिकाओं। Decellularization के बाद, गुर्दे पाड़ एक कस्टम डिजाइन छिड़काव बायोरिएक्टर पोत के अंदर रखा जाता है, और catheterized वृक्क धमनी से मिलकर छिड़काव सर्किट से जुड़ा है: एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप; ट्यूबिंग; और पीएच, भंग ऑक्सीजन, और दबाव के लिए वैकल्पिक जांच। Peracetic एसिड और इथेनॉल, और पीएच (7.4) के बीच संतुलन साधने के साथ पाड़ स्टरलाइज़ के बाद, गुर्दे पाड़ एक larg भीतर संस्कृति के माध्यम से छिड़काव के माध्यम से बोने के लिए तैयार किया जाता हैई-क्षमता इनक्यूबेटर सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा और 5%। चालीस लाख गुर्दे कॉर्टिकल ट्यूबलर उपकला (RCTE) कोशिकाओं एक शारीरिक दर के प्रवाह को कम करने से पहले 15 मिनट के लिए उच्च प्रवाह के तहत पाड़ (25 मिलीग्राम / मिनट) और दबाव (~ 230 एमएमएचजी) के माध्यम से गुर्दे की धमनी के माध्यम से इंजेक्शन, और तेजी से perfused हैं (4 मिलीग्राम / मिनट)। RCTE कोशिकाओं मुख्य रूप से, वृक्क छाल के भीतर ट्यूबलर ईसीएम आला आबाद पैदा करना, और छिड़काव संस्कृति के सात दिनों में ट्यूबलर उपकला संरचनाओं के रूप में। संस्कृति के माध्यम में एक 44 माइक्रोन resazurin समाधान tubulogenesis दौरान सेल व्यवहार्यता और प्रसार का एक fluorometric, रेडॉक्स आधारित चयापचय मूल्यांकन प्रदान करने के माध्यम के आदान-प्रदान के दौरान 1 घंटे के लिए गुर्दे के माध्यम से perfused है। गुर्दे छिड़काव बायोरिएक्टर जैव रासायनिक आकलन के लिए माध्यम की गैर इनवेसिव नमूने परमिट, और कई इनलेट बंदरगाहों गुर्दे की नस या मूत्रनली के माध्यम से वैकल्पिक प्रतिगामी बोने की अनुमति देते हैं। इन प्रोटोकॉल एक साथ गुर्दे scaffolds के recellularize करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैइस प्रणाली के भीतर तेजी से मूल्यांकन के लिए संवहनी endothelial, ट्यूबलर उपकला, और स्ट्रोमल fibroblasts, सहित प्रकार की कोशिकाओं की विविधता भी है।
Introduction
अंतिम चरण गुर्दे की विफलता से पीड़ित रोगियों की संख्या में वृद्धि जारी है, प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध दाता गुर्दे की संख्या में एक गंभीर और बढ़ती कमी नहीं है। उम्मीदवारों की लगातार बढ़ती संख्या की मांग को पूरा करने में असमर्थता गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए सूचीबद्ध इंतजार मांग 1,2 पर, प्रत्यारोपण गुर्दा ग्राफ्ट अनुकूलित विकसित करने की अंतिम लक्ष्य के साथ गुर्दे अंग इंजीनियरिंग के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए प्रेरित किया। एक मरीज की अपनी कोशिकाओं से कार्य कर गुर्दा ऊतकों के निर्माण, आजीवन प्रतिरक्षादमन की आवश्यकता को समाप्त रोगियों को एक गुर्दा प्रत्यारोपण के लिए इंतजार कर डायलिसिस पर खर्च समय की मात्रा को कम, और क्रोनिक किडनी रोग के साथ और अधिक रोगियों को जीवन रक्षक प्रत्यारोपण का विस्तार होगा।
रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग कर एक गुर्दे ऊतक bioengineering की ओर पहला कदम गुर्दे पैरेन्काइमा के लिए एक सहायक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है कि एक पाड़ का विकास होता है (उदाहरण के लिए ट्यूबलर epithelial), स्ट्रोमा तंतुप्रसू, और नाड़ी कोशिकाओं की वृद्धि। प्राकृतिक अंग कोशिकी मेट्रिसेस (ECMs) से ली गई biomaterial scaffolds के उनके प्राकृतिक जैविक संरचना सहित ऊतक इंजीनियरिंग में उपयोग के लिए उन्हें वांछनीय है कि कई विशेषताएं हैं; उपयुक्त स्थूल और सूक्ष्म शारीरिक समारोह प्रदान करना; और सेलुलर biocompatibility, कोशिका आसंजन, प्रवास, और 3 remodeling रचनात्मक ऊतक को बढ़ावा देने। गुर्दे ऊतक उत्थान के लिए scaffolds के उत्पादन के लिए एक आशाजनक विधि, गुर्दे ईसीएम 4 की जटिल प्राकृतिक प्रोटीन संरचना की ज्यादा बनाए रखने के अंग के निहित वास्तु जटिलता को बनाए रखने, और bottom- के साथ जुड़े कठिनाई को दूर कि अल्लोजीनिक या xenogeneic गुर्दे की decellularization के माध्यम से है पाड़ recellularization 5 के बाद विकासशील कोशिकाओं को एक नाड़ी की आपूर्ति उपलब्ध कराने के द्वारा मोटी cellularized ऊतकों के इंजीनियरिंग अप।
छिड़काव decellularization एक प्रक्रिया में हैजो डिटर्जेंट, एंजाइमों, या अन्य सेल में खलल न डालें समाधान समान रूप से अंग 6 की संवहनी नेटवर्क के माध्यम से वितरित कर रहे हैं। इस रणनीति को खारिज कर मानव गुर्दे 9 से अकोशिकीय गुर्दे टेम्पलेट्स के विकास इसका सबूत है, पूरे अंग इंजीनियरिंग 6-8 के लिए जैविक टेम्पलेट्स, (3 डी) तीन आयामी रूप में अकोशिकीय अंग-आधारित ईसीएम scaffolds के प्राप्त करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया के रूप में स्थापित कर दिया गया है और बड़े जानवर (जैसे सुअर 10, बकरी 11) और कृंतक स्रोतों 12 से प्राप्त xenogeneic गुर्दे। विशेष रूप से, इस तरह के कृन्तकों के रूप में छोटे पशु मॉडल का उपयोग कम कोशिकाओं और स्टेम सेल व्युत्पन्न ऊतकों के साथ मामला है, सेल नंबर आमतौर पर सीमित कर रहे हैं, जिसमें अंग recellularization अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो संस्कृति मीडिया, की आवश्यकता है। वर्णित decellularization प्रोटोकॉल का लक्ष्य गुर्दे की संरचना के उत्थान के लिए एक 3 डी मचान प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक अकोशिकीय गुर्दे ईसीएम का उत्पादन होता हैमानव गुर्दे कॉर्टिकल ट्यूबलर उपकला (RCTE) कोशिकाओं के साथ उपस्थित उदाहरण में repopulated रहे हैं कि नेफ्रॉन नलिकाओं सहित तों। हम पहले से अधिक तेजी से है जो एक इष्टतम, डिटर्जेंट आधारित चूहा गुर्दा decellularization प्रोटोकॉल 7, जैसा कि पहले बताया अन्य तरीकों की तुलना में (लगभग एक दिन) के बारे में हमारी कठोर मूल्यांकन वर्णित (रॉस एट अल .- 5 दिन 12, गीत एट अल .- 4.5 दिनों 13), और पूर्व रिपोर्टों 12-15 की तुलना में decellularization दौरान विकृतिकरण करने वाला साधन सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के एक काफी कम एकाग्रता (0.1%) करने के लिए अंग को उजागर करता है।
अध्ययन का एक सीमित संख्या में सेलुलर repopulation के लिए एक 3 डी पाड़ के रूप में decellularization और बाद में उपयोग के लिए कृंतक गुर्दे के उपयोग का वर्णन किया है 12-16 (अन्यत्र 1 समीक्षा)। इस प्रोटोकॉल में, हम अकोशिकीय गुर्दे scaffolds के उत्पादन के लिए हमारे पहले से स्थापित है, इष्टतम decellularization रणनीति का विस्तृत विवरण प्रदानSprague Dawley चूहे गुर्दे 7 से। दोहरी बोने और रखरखाव छिड़काव संस्कृति 17 में सक्षम कस्टम डिजाइन छिड़काव बायोरिएक्टर का उपयोग करना, हम लगातार इन decellularized matrices में ट्यूबलर घटक फिर से आबाद पैदा करना, और एक सप्ताह से अधिक छिड़काव संस्कृति में जीवित है, जो मानव RCTE कोशिकाओं, साथ अकोशिकीय गुर्दे scaffolds के recellularize। 17 का अध्ययन पहले से cytotoxicity के लिए इस्तेमाल एक सस्ती, गैर साइटोटोक्सिक, और गैर इनवेसिव चयापचय आकलन – – समय पर 7 recellularized गुर्दे के भीतर सेल व्यवहार्यता और प्रसार का एक संकेत प्रदान करने के लिए हम आगे resazurin छिड़काव परख के हमारे इस्तेमाल प्रदर्शित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित decellularization प्रोटोकॉल लगातार संवहनी endothelial कोशिकाओं 7,17 के अलावा, (प्रॉक्सिमल और बाहर दोनों छोटी नली व्युत्पन्न) मानव गुर्दे कॉर्टिकल ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक 3 डी टेम्पलेट के र?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
