Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

מבחני מבוססי תאי Mechano רגישים לאפשר לחקירת תאים חסיד, עם מגוון רחב של יישומים המשקפים את התפקיד המרכזי שמכניקה יכולה לשחק בביולוגיה של תא. יישומים אלה לעתים קרובות להתמקד במנגנונים המניעים את תהליכי subcellular או כל תא התנהגות. מצד אחד, גורמים סביבתיים חיצוניים, כגון הרכב נוסף סלולארי מטריצה ​​או מטריצת קשיחות יכולים להשפיע באופן דרמטי את התגובה המכנית וביולוגית של תא. ¹ ניתן לראות אותו לאחר שימוש בכיתות רבות של תרכובות פעילים pharmaceutically, את ההשפעות של אשר לעתים קרובות מאופיין באמצעות מודלים תרבית תאים. ² בנכסים האחרים יד genotypic, כגון אלה הנגרמים על ידי מוטציות גנטיות ספונטניות או מושרה בניסוי, יכול לגרום לשינויים מסומנים בפנוטיפ תא הקשורים לשינויים במבנה שלד התא ותפקודו. ³ דוגמאות אלה רק כמה מן רבים אפשרייםנושאים שphenotyping המכני של תאים הוא רלוונטי, וכל אלה נחקרו מועילים עם מערכי micropost.

בשעת כתיבה זו, כ -200 מאמרים פורסמו מתארים אינטראקציה התא-micropost. עבודות אלה לדון בהיבטים התיאורטיים של עקרונות סטיית micropost כמו גם הוראות מעשיות בייצור שלהם. המאמר הראשון המתאר את האינטראקציה של תאים ומערכי micropost גמישים פורסם על ידי טאן ועמיתים בשנת 2003. ⁴ בניגוד למיקרוסקופ הקלאסי כוח המתיחה (TFM) שבו מצעים רכים רציפים משמשים לאמידת התכווצות תא nanonewton קנה מידה, טאן et al. תאר שיטה באמצעות קורות אנכיות צפופות מרובות עשויות אלסטומר סיליקון. היתרונות העיקריים של שיטה זו עולים משתי תכונות עיקריות. ראשון כדי לשנות את מצע נוקשות תא-לכאורה צריך רק לשנות את ממדי micropost תוך שמירההרכב המצע אחר קבוע ובכך להימנע מהבדלים בטופולוגיה משטח וכימיה. microposts השני מתנהג כמו מעיינות בודדות שניתן לנתח דיסקרטי עם כוח והחלטות מרחבית על סדר הידבקויות מוקד בודדים ויכול להפחית את האתגרים אנליטיים שטבועים לניתוח דומה על ידי TFM הסטנדרטי.

היום המגוון הרחב של יישומים למערכי micropost עולה בהרבה על רק המיפוי של כוחות לכמה תאים בודדים. לדוגמא, אקיאמה מדווחת על שימוש ברקמת כלי גב מבודד מזחל עש כמפעיל למערך micropost, על מנת לפתח מיקרו-רובוט אוטונומי המונע בשריר חרקים. ⁵

עם זאת, יישומים שפורסמו רוב microposts התמקדו במחקרים של מצבים רפואיים כמו זיהום או סרטן. לדוגמא, מערכי micropost שימשו ללמוד דור הכוח של פילי סוג IV ארוזים של gonorrh Neisseriaמושבות oea המשויכת למפלי אות שיפור זיהום. ⁶ אחרים השתמשו microposts ללמוד תאי סרטן השד שטופלו בתרופות תרכובות מיקוד שלד התא. ⁷

סטייה של micropost מתוארת לעתים קרובות תוך שימוש בתאוריה קלסית קרן לשלוחה עם עומס סוף ההנחה התא מייחס רק לקצה קצו של micropost. כאן F הכוח ליישם שגורם δ סטייה תלוי בk "קשיחות כיפוף" של micropost ומחושב על ידי:

(1)

עם E, אני, ולהיות L מודולוס של יאנג, רגע תחום אורך אינרציה וקרן בהתאמה. עם זאת, תוצאות ממשוואה זו נותנת קירוב כללי של הכוחות בעבודה מאז גז קרן וכיפוף גם רק כהשתאה מצע אינם נלקחים בACלִסְפּוֹר. בהתחשב בכך שmicroposts עשוי בדרך כלל מחומרים רכים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) מבוסס גומי סיליקון הגורמים האלה צריכים להיות כלולים. . שון et al הראה שיש גורם תיקון כזה המבוסס על היחס של micropost (L / D) ונ 'יחס פואסון של הפולימר המתאים ⁸ זה ניתן על ידי.:

(2)

עם _ההטיה T (v) להיות מקדם הטיה הכולל הולם פרמטר = 1.3 ניתן למצוא כמו באותו המאמר:

(3)

כלומר, הנוקשות המתוקנות של micropost k _קור היא התוצר של K = _עיקול k כיפוף קשיחות הטהור וגורם תיקון קורניתנו על ידי:

(4)

לכן, יש לבצע חישובי כוח התא באמצעות הווריאציה מעודנת יותר של משוואה (1) קוראים עכשיו:

(5)

ההשפעה של התיקון הופכת להיות ברורה יותר ברגע שהערכים אופייניים לממדי micropost משמשים. לדוגמא, micropost ארוך 15 מיקרון עם חתך עגול וקוטר של 5 מיקרומטר עשוי מגומי סיליקון מבוסס PDMS מוביל לגורם תיקון של 0.77 ולכן חישוב מתוקן היה להעריך את כוחות התא המופעל על ידי 23%. זה הופך להיות אפילו יותר קשה לmicroposts עם ההיבט ratios הקטן יותר.

באופן מסורתי, ניתוח תמונת micropost גם היה מבוסס על תיאורית כיפוף קרן האידיאלית. בשנת 2005 הקבוצה שהיה חלוצה בשימוש בMICRמערכי opost פורסמו תוכנת ניתוח תמונה המתאימה לניתוח micropost ⁹ התוכנה דורשת רישיון תוכנה והמשתמש חייב לקחת שלוש תמונות לכל תפקיד.; אחד מכל המטוסים העליונים ותחתונים של micropost במצב הולכה ועוד אחד במצב הקרינה עם התא המוכתם. לאחר השוואת העמדות העליונה ותחתונים לכל micropost התוכנה קובעת שדה כוח וקטור ומחשבת פרמטרים הקשורים כמו כוח למשרה. חבילות תוכנה אחרות קיימות ועקרונות ניתוחם מוזכרים בקצרה במאמרים המקביל המתארים אותם, אבל חבילות תוכנה אנליטיים אלה הן בדרך כלל לא זמינות לציבור. ^10,11

מערכי micropost מיועדים לכוחות תא מיפוי יכולים להיות מסווגים כאו להיות בפריסה מאונך micropost או אחד משושה, האחרון שבם יש את היתרון של פערים במרחק שווה בין כל microposts השכן. חה microposts הטיפוסייש חתך עגול וממדיהם נעים בין 1.0 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר בקוטר 2 עד 50 מיקרומטר באורך. ⁴ עם זאת, microposts עם חתך אליפטי או מרובע גם דווח. ^12,13

השימוש בתערובות סיליקון מבוסס PDMS כחומר micropost מאפשר להוספת חלקיקים לתוך התערובת. לדוגמא הוספת ננו-מוטות קובלט מאפשר הפעלה מגנטית של micropost ובכך נותן עוד תואר של חופש עיצובים ניסיוניים פוטנציאל. ¹⁴ רוב הקבוצות לייצר מערכי micropost על מצעים קשיחים שטוחים כמו מכסה זכוכית או בתוך צלחת פטרי. עם זאת, מאן ועמיתים לעבודה דיווחו לאחרונה מערך micropost נוצר על קרום מתיחה. ¹⁵ זה מאפשר היישום של כוחות תא מתיחה לתאים חסיד בזמן לימודי תגובות דינמיות לחיות תאי subcellular במונחים של התכווצות תא.

ורוב estab המועסקים נרחבתהליך lished להכנת מערכי micropost מבוסס על יתוגרפיה הרכה כפי שתואר בפרוטוקולים תובנה של Sniadecki ועמיתים. ^16-18 בתהליכי חדר נקי סטנדרטיים קצרים משמשים ליצירת microstructures על גבי פרוסות סיליקון באמצעות photoresist SU8. זה ואחריו תהליך העתקה שבו גומי סיליקון הוא יצוק על מבני העברתם לתוך תבניות. בשלב שני תבניות אלה משמשות לשכפל מיקרו הראשוני באמצעות גומי סיליקון על גבי מצע נבחר. עם זאת, למרות המספר הגדול והולך וגדל של פרסומים הקשורים ליישומם, הקמת תהליך ייצור לmicroposts לוקח כמות ניכרת של זמן אפילו למומחי מיקרו-הנדסה; יש שלבי תהליך רבים הדורשים אופטימיזציה והתאמה לסביבת המעבדה הספציפית ופריסת micropost להניב רמת איכות מקובלת.

מערכי micropost מסחריים זמינים כעת במוכן-tפורמט o-שימוש ("מחוץ למדף") עם איכות גבוהה באופן עקבי. ככזה הוא אלטרנטיבה לתהליך הייצור המורכב וארוך הנדרש לייצור באתר. במאמר זה מערך micropost זמין מסחרי שימש למיפוי כוחות סלולריים באמצעות תמונת מיקרוסקופ שדה בהיר אחד. חשוב ממאמר זה מתאר ומתעד תוכנת מלוא תפקודי קוד פתוח בשם MechProfiler, שזמינה להורדה כחומר משלים לכתב היד הזה. ניתן למצוא גם גרסה נשמרה באופן פעיל של התוכנה בhttp://www.orthobiomech.ethz.ch.

השילוב של assay "מחוץ למדף" ותוכנת ניתוח קוד פתוח תואמת במידה ניכרת מוריד את משוכת הכניסה להשיג ניסויי TFM מדויקים. חוקרים ללא גישה למתקנים או חדר נקיים או מומחיות בפיתוח תוכנה יכולים לנתח כוחות סלולריים בהצלחה. זה מאפשר למשתמש להתמקד בmechanosפלט ensitivity assay ולא הטכנולוגיה עצמה, ועושה מדידות כוח המתיחה זמינות לקהילה רחבה יותר. יתר על כן, זה הוא צעד חשוב כדי לסלול את הדרך לכיוון הקרנה אוטומטית מלא של מערכי micropost.

תוכנת ניתוח MechProfiler מעבדת תמונות בפורמט קובץ TIFF, PNG, BMP ו- JPG. ניתן לקחת את התמונות באמצעות הקרינה, לעומת שלב או מיקרוסקופ אור בהיר השדה. התכנית העצמאית פועלת יחד עם Matlab מהדר זמן הריצה החופשי (זמינה בכתובת: איור 12) ואלגוריתמים בסיסיים לאפשר לעיבוד תמונה יעיל, המאפשר למשתמש לעיבוד תמונות עם תאים בודדים או מרובים בכ -1 דקות. יתר על כן, תאים אלה יכולים גם להיות חיים או "קבוע".

תוכנת MechProfiler יכולה להגדיל את תפוקת ניתוח נתונים רבה על ידי הסתמכות על שחזור של מערכי micropost המסחרי האיכותי, # ספציפי יותר, ברירת המחדל ו8220;-הסיט אינם "עמדה של כל הודעה במערך ניתן להניח נגד רשת אידיאלית (סטיות ייצור לרשת במערכים המשמשים למחקר זה היו פחות מ -100 ננומטר).

בקיצור אחד פותח בחירה של קבצי תמונה לניתוח, יבוליהם לאזור של עניין, מגדיר את ההודעות מכוסות על ידי תאים או שצריך להיות מושלך, קובע פוסט עמדות, מחשבים את הסטיות / כוחות נגד הרשת האידיאלית, ולבסוף שומר את כל נתוני התא ספציפי עם אפשרות ליצוא, כולל לגיליון אלקטרוני משרדי סטנדרטי.

Protocol

1. תאים culturing על מערכי Micropost הערה: כל הצעדים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית על מנת להבטיח סטריליות. הכרכים הניתנים כאן הם לצלוחיות תרבית תאי T25. צפיפות המתכון וזריעת תאי תרבית תאים בינונית מותאמות לשורות תאי סרטן עצמות HuO9 וM132. </p…

Representative Results

היתרון העיקרי של הטכניקה המתוארת טמון בפשטות שלה ופוטנציאל להשתלבות מהירה ויעילה לעבודת מעבדה שגרתית. השילוב של מערכי חיישן מסחריים באיכות גבוהה יחד עם תוכנות קוד פתוח מספק מידע על mechano-רגישות שאחרת היה דורש גישה למתקני חדר נקי ובידע המעמיק של ניתוח תמונה ופיתוח תוכ…

Discussion

עבודה זו מבקשת לקדם את התחום של כוח המתיחה מיקרוסקופי על ידי באופן משמעותי הפחתת מחסומים טכניים ומעשיים לכניסה. מחסומים אלה באים משני צדדים. בראש ובראשונה הם האתגרים הטכניים לא טריוויאלית הרבים שיש להתגבר כדי לייצר reproducibly וניסוי עמלה מערך micropost. שנית, הוא הצורך באופן…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera