Nem og præcis mekanisk-profilering på Micropost Arrays

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Mekanisk-sensitive cellebaserede assays tillader undersøge vedhængende celler, med en bred vifte af applikationer, der afspejler den centrale rolle, som mekanikere kan spille i cellebiologi. Disse applikationer fokuserer ofte på de underliggende mekanismer, der driver subcellulære processer eller hel-celle adfærd. På den ene side kan eksterne miljøfaktorer såsom ekstra cellulær matrix sammensætning eller matrix stivhed dramatisk påvirke mekanisk og biologisk respons i en celle. ¹ Det samme kan iagttages efter anvendelse af mange klasser af farmaceutisk aktive forbindelser, hvis virkninger er ofte karakteriseret ved anvendelse cellekulturmodeller. ² På den anden side genotypiske egenskaber, såsom dem, der forårsages af spontane eller eksperimentelt induceret genetiske mutationer, kan inducere markante ændringer i cellefænotype, der er forbundet med ændringer i cytoskelettet struktur og funktion. ³ Disse eksempler er blot nogle få af de mange muligeemner for hvilke mekaniske fænotypebestemmelse af celler er relevant, og alle disse er blevet fordel undersøgt med micropost arrays.

På tidspunktet for dette skrives, har ca. 200 artikler er blevet offentliggjort som beskriver celle-micropost interaktion. Disse værker diskuterer teoretiske aspekter af micropost afbøjning principper samt praktiske instruktioner om deres fremstilling. Den første artikel, der beskriver samspillet mellem celler og fleksible micropost arrays blev udgivet af Tan og kolleger i 2003. ⁴ I modsætning til klassiske trækkraft mikroskopi (TFM), hvor der anvendes kontinuerlig bløde underlag at estimere nanonewton skala celle kontraktilitet, Tan et al. der beskrevet en fremgangsmåde ved hjælp af flere tætliggende lodrette bjælker fremstillet af silikoneelastomer. De vigtigste fordele ved denne teknik frem fra to vigtigste funktioner. Først for at ændre celle-substrat tilsyneladende stivhed man behøver blot at ændre micropost dimensioner, samtidig med atsubstratet sammensætningen ellers konstant og således undgå forskelle i overfladen topologi og kemi. Anden microposts opfører sig som individuelle fjedre, der kan diskret analyseret med kraft og rumlige beslutninger om rækkefølgen af ​​de enkelte fokale sammenvoksninger og kan reducere de analytiske udfordringer, der er forbundet til en tilsvarende undersøgelse af standard TFM.

I dag rækken af ​​applikationer til micropost arrays langt overstiger bare kortlægning af kræfter i et par enkelte celler. For eksempel, Akiyama rapporterer anvendelsen af et isoleret dorsal fartøj væv fra et møl larve som en aktuator til en micropost array, med henblik på at udvikle et insekt muskel-drevne autonome mikro-robot. ⁵

Imidlertid har de fleste offentliggjorte anvendelser af microposts fokuseret på studier af medicinske tilstande som infektion eller cancer. For eksempel har micropost arrays blevet brugt til at studere den kraft generation af bundtet type IV pili af Neisseria gonorrhOEA kolonier, der er forbundet med signal kaskader øge infektion. ⁶ Andre har anvendt microposts at studere brystkræftceller behandlet med farmaceutiske forbindelser målrettet cytoskelettet. ⁷

Afbøjning af en micropost beskrives ofte ved hjælp af klassisk stråle teori for en cantilever med en belastning ende antager cellen lægger kun til den meget spids af micropost. Her den påførte kraft F, der forårsager en deformation δ afhænger af micropost s "bøjningsstivhed" k og beregnes ved formlen:

(1)

med E, I og L er den Youngs modul, område inertimoment og stråle længde hhv. Men resultaterne fra denne ligning kun give en generel tilnærmelse af de kræfter på arbejde, da strålen klipning og bøjning samt ikke tages i ac substrat vridningtælle. Betragtning af, at microposts typisk er lavet af bløde materialer som polydimethylsiloxan (PDMS) -baseret silikonegummi disse faktorer skal medtages. . Schoen et al viste, at der er sådan en korrektionsfaktor baseret på billedformatet af micropost (L / D) og den tilsvarende polymer er Poisson-forhold v ⁸ Det er givet ved.:

(2)

Med T _tilt (v) er en vippe koefficient, der omfatter montering parameter a = 1,3, som kan findes i samme artikel:

(3)

Det betyder en micropost korrigerede stivhed k _corr er produktet af den rene bøjningsstivhed k = k _{bøjes og} korrektionsfaktoren corrgivet ved:

(4)

Derfor bør celle kraft beregninger udføres ved hjælp af mere raffineret variant af ligning (1) nu læser:

(5)

Virkningen af ​​korrektionen bliver mere tydelig, så snart typiske værdier for micropost dimensioner anvendes. For eksempel, en 15-mikron lange micropost med et cirkulært tværsnit og en diameter på 5 um lavet af PDMS-baserede silikonegummi fører til en korrektionsfaktor på 0,77 og dermed en ukorrigeret beregning ville overvurdere de udøves celle kræfter med 23%. Dette bliver endnu mere alvorlig for microposts med mindre størrelsesforhold.

Traditionelt har micropost billedanalyse også været baseret på idealiserede stråle bøjning teori. I 2005 den gruppe, der pioner brugen af ​​MICRopost arrays offentliggjort et billede analyse software velegnet til micropost analyse ⁹ Softwaren kræver en softwarelicens, og brugeren skal tage tre billeder for hver position.; én fra hver af micropost top og bund fly i transmissionstilstand og en anden i fluorescens mode med den farvede celle. Efter at have sammenlignet den øverste og nederste positioner for hver micropost softwaren bestemmer en kraft vektor felt og beregner relaterede parametre såsom kraft pr indlæg. Der findes andre softwarepakker, og deres analyse principper er kort omtalt i de tilsvarende artikler, der beskriver dem, men disse analytiske softwarepakker er generelt ikke offentligt tilgængelige. ^10,11

De micropost arrays designet til kortlægning celle kræfter kan klassificeres som enten værende i en ortogonal micropost layout eller en sekskantet en, hvor sidstnævnte har den fordel, ækvidistante huller mellem alle nabo microposts. Typiske microposts have et cirkulært tværsnit og deres dimensioner i området fra 1,0 um til 10 um i diameter og 2 til 50 um i længden. ⁴ dog microposts med elliptisk eller kvadratisk tværsnit er også blevet rapporteret. ^12,13

Anvendelsen af ​​PDMS-baserede siliconeblandinger som micropost materiale giver mulighed for at tilføje nanopartikler i blandingen. For eksempel tilføje kobolt nano-stænger giver en magnetisk aktivering af micropost og dermed giver en anden grad af frihed til potentielle forsøgsdesign. ¹⁴ De fleste grupper producere deres micropost arrays på flade stive substrater som dækglas eller inde i en petriskål. Men Mann og medarbejdere for nylig rapporteret en micropost matrix dannet på et strækbart membran. ^15. Dette tillader anvendelsen af celle strækker kræfter til adhærente celler, mens de studerer levende celle subcellulære dynamiske respons i form af celle kontraktilitet.

Den bredt anvendte og mest Estabnedsat fremgangsmåde til fremstilling micropost arrays er baseret på blødt litografi som beskrevet i de indsigtsfulde protokoller Sniadecki og kolleger. ^16-18 i korte standard renrum fremgangsmåder anvendes til at generere de mikrostrukturer oven på en siliciumskive ved anvendelse af SU8 fotoresist. Dette efterfølges af en kopiering hvor silicone-gummi er støbt i de strukturer, overføre dem i forme. I et andet trin disse forme anvendes til at gengive den oprindelige mikrostruktur under anvendelse af siliconegummi på toppen af ​​en valgt substrat. Men på trods af den store og voksende antal publikationer i forbindelse med deres ansøgning, om oprettelse af en fremstillingsproces for microposts tager megen tid, selv for mikro-engineering eksperter; der er mange procestrin, der kræver optimering og tilpasning til den specifikke lab miljø og micropost layout til at give et acceptabelt kvalitetsniveau.

Kommercielle micropost arrays er nu tilgængelige i en færdig to-brug ("off-the-shelf") format med en ensartet høj kvalitet. Som sådan er de et alternativ til den komplekse og langvarige fremstillingsproces der kræves til produktion på stedet. I dette papir en kommercielt tilgængelig micropost matrix blev anvendt til kortlægning cellulære kræfter ved hjælp af en enkelt lysfeltsbillede mikroskopi billede. Endnu vigtigere denne artikel beskriver og dokumenterer en fuldt funktionel open source-software ved navn MechProfiler, som kan hentes som supplerende materiale til dette manuskript. En aktivt vedligeholdt version af softwaren kan også findes på http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Kombinationen af ​​en "off-the-shelf" assay og et kompatibelt open source analyse software sænker markant posten hurdle for at opnå nøjagtige TFM eksperimenter. Forskere uden adgang til enten rene rum faciliteter eller softwareudvikling ekspertise kan analysere cellulære kræfter med succes. Det gør det muligt for en bruger at fokusere på de mechanosensitivity assay output snarere end selve teknologien, og gør trækkraft målinger til rådighed for et bredere samfund. Desuden er dette er et vigtigt skridt til at bane vejen for fuldautomatisk screening af micropost arrays.

Den MechProfiler analyse software behandler billeder i filformatet tiff, png, bmp og jpg. Billederne kan tages ved hjælp af fluorescens, fasekontrast eller lysfeltsbillede lysmikroskopi. Den enkeltstående program løber sammen med den frie Matlab Compiler Runtime (findes på: figur 12) og underliggende algoritmer giver mulighed for strømlinet billedbehandling, der giver brugeren mulighed for at behandle billeder med enkelte eller flere celler i omkring 1 min. Endvidere kan disse celler enten levende eller "faste".

Den MechProfiler software er i stand til i høj grad at øge dataanalyse gennemløb ved at stole på reproducerbarhed af kvalitet kommerciel micropost arrays, mere specifikt, standard & #8220, ikke-afbøjet "position for hver stilling i array kan formodes mod en ideel gitter (fremstillingsvariationer til nettet i arrays anvendes til denne undersøgelse var mindre end 100 nm).

Kort sagt man åbner et udvalg af billedfiler til analyse, beskærer dem til regionen af ​​interesse, definerer stillinger omfattet af celler, eller som har brug for at blive kasseret, bestemmer indlæg positioner, beregner omlægninger / kræfter mod den ideelle nettet, og endelig gemmer alle celle-specifikke data med mulighed for eksport, herunder til en standard kontor regneark.

Protocol

1. dyrkning af celler på Micropost Arrays Bemærk: Alle trin skal udføres i et biosikkerhed kabinet for at sikre sterilitet. De her givne mængder er for T25 celledyrkningskolber. Celledyrkningsmediet opskrift og cellepodning densitet er optimeret til knoglekræft cellelinier HuO9 og M132. Forbered en cellekultur til såning på et micropost array. Inspicere cellekultur kvalitet ved at placere kulturen kolben på en standard lysmikroskop. Sikre, at cellerne viser en typ…

Representative Results

Den største fordel ved den beskrevne teknik ligger i dens enkelhed og potentiale for hurtig og effektiv integration i rutinemæssig lab arbejde. Kombinationen af høj kvalitet kommercielle sensor arrays parret med open source-software indeholder oplysninger om mekanisk-følsomhed, der ellers ville kræver adgang til renrumsfaciliteter og dybdegående kendskab til billedanalyse og softwareudvikling. Figur 1 illustrerer arbejdsgangen i den præsenterede metode. Det starter med at forberede og såning cel…

Discussion

Dette arbejde tilstræber at fremme inden for trækkraft mikroskopi ved væsentligt at sænke tekniske og praktiske adgangsbarrierer. Disse hindringer kommer fra to sider. Først og fremmest er de mange ikke-trivielle tekniske udfordringer, der skal overvindes for at reproducerbart fremstille og eksperimentelt bestille en micropost array. For det andet, er tilsvarende ikke-triviel behov for en pålidelig semi-automatiseret analyse af encellede kræfter – holde sig for øje, at et typisk forsøg kan kræve analysen af ?…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera