Micropost सारणियों पर आसान और सटीक Mechano-प्रोफाइलिंग
Summary
Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.
Abstract
Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.
Introduction
Mechano के प्रति संवेदनशील सेल आधारित assays यांत्रिकी कोशिका जीव विज्ञान में खेल सकते हैं कि केंद्रीय भूमिका को प्रतिबिंबित कि आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ, पक्षपाती कोशिकाओं की जांच के लिए अनुमति देते हैं। इन आवेदनों अक्सर subcellular प्रक्रियाओं या पूरे सेल व्यवहार कि ड्राइव अंतर्निहित तंत्र पर ध्यान केंद्रित। एक तरफ, इस तरह के अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स संरचना या मैट्रिक्स कठोरता के रूप में बाह्य पर्यावरणीय कारकों नाटकीय रूप से एक सेल के यांत्रिक और जैविक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। एक ही pharmaceutically सक्रिय यौगिकों के कई वर्गों के उपयोग के बाद मनाया जा सकता है, जिसके प्रभाव से कर रहे हैं अक्सर सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग होती है। 2 ऐसे cytoskeleton संरचना और समारोह में परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं कि सेल phenotype में चिह्नित परिवर्तन के लिए प्रेरित कर सकते हैं सहज या प्रयोगात्मक प्रेरित आनुवंशिक परिवर्तन की वजह से उन के रूप में दूसरी ओर genotypic गुण, पर। 3 ये उदाहरण हैं कई संभव के कुछ हीविषयों के लिए जो कोशिकाओं के यांत्रिक phenotyping के लिए प्रासंगिक है, और इनमें से सभी उपयोगी micropost सरणियों के साथ जांच की गई है।
इस लेखन के समय में, लगभग 200 लेख सेल micropost बातचीत का वर्णन प्रकाशित किया गया है। ये काम करता है micropost विक्षेपन सिद्धांतों के सैद्धांतिक पहलुओं के साथ ही उनके निर्माण पर व्यावहारिक निर्देश पर चर्चा की। कोशिकाओं और लचीला micropost सरणियों की बातचीत का वर्णन पहला लेख निरंतर नरम substrates टैन एट अल nanonewton पैमाने पर सेल सिकुड़ना, अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जहां क्लासिक कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी (TFM) के विपरीत 2003 4 में टैन और उनके सहयोगियों द्वारा प्रकाशित किया गया था। सिलिकॉन elastomer के बने कई निकट दूरी पर खड़ी उपयोग कर मुस्कराते हुए एक विधि का वर्णन किया। इस तकनीक का मुख्य लाभ के दो प्रमुख सुविधाओं से उभरेगा। जबकि रखते हुए सबसे पहले सेल स्पष्ट सब्सट्रेट कठोरता को बदलने के क्रम में एक ही micropost आयाम बदलने की जरूरत हैअन्यथा स्थिर है और इस तरह की सतह टोपोलॉजी और रसायन शास्त्र में मतभेद से बचने सब्सट्रेट रचना। दूसरा microposts कड़ाई से व्यक्तिगत फोकल adhesions के आदेश पर बल और स्थानिक संकल्प के साथ विश्लेषण किया जा सकता है और मानक TFM द्वारा अनुरूप विश्लेषण के लिए निहित हैं कि विश्लेषणात्मक चुनौतियों को कम कर सकते हैं कि व्यक्ति स्प्रिंग्स की तरह काम करते हैं।
आज micropost सरणियों के लिए आवेदनों की रेंज बहुत कुछ एकल कक्षों के लिए बलों की सिर्फ मानचित्रण से अधिक है। उदाहरण के लिए, Akiyama एक कीट पेशी संचालित स्वायत्त सूक्ष्म रोबोट विकसित करने के क्रम में, एक micropost सरणी के लिए एक actuator के रूप में एक कीट कमला से एक अलग पृष्ठीय पोत ऊतक के उपयोग की रिपोर्ट। 5
हालांकि, microposts की सबसे प्रकाशित अनुप्रयोगों संक्रमण या कैंसर जैसे चिकित्सा की स्थिति के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है। उदाहरण के लिए, micropost सरणियों नेसेरिया gonorrh के बंडल प्रकार चतुर्थ पिली के बल पीढ़ी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। संकेत झरने संक्रमण को बढ़ाने के साथ जुड़ा हुआ है 6 अन्य cytoskeleton को लक्षित दवा यौगिकों के साथ इलाज स्तन कैंसर की कोशिकाओं का अध्ययन करने के microposts का इस्तेमाल किया है कि OEA कालोनियों। 7
एक micropost के नीचे को झुकाव अक्सर सेल संभालने का अंत भार के साथ एक ब्रैकट के लिए शास्त्रीय किरण सिद्धांत का उपयोग वर्णित है केवल micropost की बहुत टिप के लिए देता है। एक विक्षेपन δ का कारण बनता है कि यहाँ लागू बल एफ micropost के "झुकने कठोरता" कश्मीर पर निर्भर करता है और कर की जाती है:
(1)
ई, मैं, और एल जा रहा है यंग मापांक, क्रमशः जड़ता और किरण लंबाई के क्षेत्र पल के साथ। सब्सट्रेट warping के एसी में नहीं ले रहे हैं लेकिन, जैसा कि इस समीकरण से परिणाम केवल किरण कर्तन के बाद से काम और के रूप में अच्छी तरह से झुकने पर बलों की एक सामान्य सन्निकटन देगिनती। Microposts आम तौर पर polydimethylsiloxane (PDMS) की तरह नरम सामग्री से बना रहे हैं कि ध्यान में रखते हुए इन कारकों को शामिल किए जाने की जरूरत है सिलिकॉन रबर आधारित। । Schoen एट अल micropost (एल / डी) और इसी बहुलक का पॉसों अनुपात वी के पहलू अनुपात के आधार पर इस तरह के एक सुधार कारक है कि वहाँ का प्रदर्शन 8 यह द्वारा दिया जाता है।:
(2)
टी झुकाव (v) एक ही लेख में पाया जा सकता है के रूप में फिटिंग पैरामीटर एक = 1.3 शामिल है कि एक झुकने गुणांक होने के साथ:
(3)
यही कारण है कि एक micropost के सुधारा कठोरता कश्मीर CORR शुद्ध झुकने कठोरता कश्मीर = कश्मीर मोड़ के उत्पाद और सुधार कारक CORR इसका मतलब यह हैद्वारा दिए गए:
(4)
इसलिए, सेल बल गणना अब पढ़ समीकरण (1) के और अधिक परिष्कृत भिन्नता का उपयोग किया जाना चाहिए:
(5)
सुधार के प्रभाव के रूप में जल्द ही micropost आयामों के लिए विशिष्ट मूल्यों उपयोग किया जाता है के रूप में और अधिक स्पष्ट हो जाता है। उदाहरण के लिए, एक परिपत्र पार अनुभाग और PDMS आधारित सिलिकॉन रबर के बने 5 माइक्रोन की एक व्यास के साथ एक 15 माइक्रोन लंबे micropost 0.77 की एक सुधार कारक की ओर जाता है और इसलिए एक अनुशासनहीन गणना 23% द्वारा लगाए गए सेल बलों overestimate होगा। यह और भी अधिक गंभीर छोटे पहलू अनुपात के साथ microposts के लिए हो जाता है।
परंपरागत रूप से, micropost छवि विश्लेषण भी आर्दश किरण झुकने के सिद्धांत पर आधारित है। 2005 में माइकर के उपयोग का बीड़ा उठाया है कि समूहopost सरणियों micropost विश्लेषण के लिए अनुकूल एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रकाशित 9 सॉफ्टवेयर एक सॉफ्टवेयर लाइसेंस की आवश्यकता है और उपयोगकर्ता प्रत्येक पद के लिए तीन छवियों ले लेना चाहिए। प्रसारण विधा और दाग सेल के साथ प्रतिदीप्ति मोड में एक दूसरे में micropost के ऊपर और नीचे के विमानों से एक-एक। प्रत्येक के लिए ऊपर और नीचे के पदों पर तुलना करने के बाद सॉफ्टवेयर एक बल वेक्टर क्षेत्र निर्धारित करता है और पोस्ट के अनुसार बल की तरह संबंधित मानकों की गणना करता है micropost। अन्य सॉफ्टवेयर संकुल मौजूद हैं और उनके विश्लेषण के सिद्धांतों उन्हें संक्षेप में वर्णन है कि इसी लेख में उल्लेख कर रहे हैं, लेकिन इन विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर संकुल आम तौर पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। 10,11
मानचित्रण सेल बलों के लिए डिज़ाइन किया गया micropost सरणियों सभी पड़ोसी microposts के बीच समान दूरी के अंतराल का फायदा है जो बाद के एक orthogonal micropost लेआउट या एक हेक्सागोनल एक में किया जा रहा है या तो के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। ठेठ microposts हाएक परिपत्र पार अनुभाग किया है और उनके आयाम अण्डाकार या वर्ग पार अनुभाग के साथ microposts भी सूचित किया गया है, हालांकि लंबाई में 50 माइक्रोन से 1.0 माइक्रोन के लिए व्यास में 10 माइक्रोन और 2। 4 लेकर। 12,13
micropost सामग्री के रूप में PDMS आधारित सिलिकॉन मिश्रण का इस्तेमाल मिश्रण में नैनोकणों जोड़ने के लिए अनुमति देता है। कोबाल्ट नैनो-छड़ जोड़ने उदाहरण के लिए micropost की एक चुंबकीय सक्रियण सक्षम बनाता है और इस प्रकार संभावित प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए स्वतंत्रता का एक और डिग्री देता है। 14 अधिकांश समूहों कवर कांच की तरह या एक पेट्री डिश के अंदर फ्लैट कठोर substrates पर उनकी micropost सरणियों का उत्पादन। हालांकि, मान और सह कार्यकर्ताओं ने हाल ही में एक stretchable झिल्ली पर गठित एक micropost सरणी की सूचना दी। 15 सेल सिकुड़ना के मामले में रहते सेल subcellular गतिशील प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करते हुए यह पक्षपाती कोशिकाओं को सेल खींच बलों के आवेदन की अनुमति देता है।
व्यापक रूप से कार्यरत हैं और सबसे स्थापितSU8 photoresist का उपयोग कर एक सिलिकॉन वेफर के शीर्ष पर microstructures उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कम मानक cleanroom प्रक्रियाओं में Sniadecki और सहकर्मियों। 16-18 की व्यावहारिक प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में micropost सरणियों बनाने के लिए lished प्रक्रिया नरम लिथोग्राफी पर आधारित है। यह सिलिकॉन रबर सांचों में उन्हें स्थानांतरित संरचनाओं पर डाली है जिसमें एक नकल की प्रक्रिया के बाद है। एक दूसरे चरण में इन नए नए साँचे एक चुना सब्सट्रेट के शीर्ष पर सिलिकॉन रबर का उपयोग करते हुए प्रारंभिक microstructure को दोहराने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि microposts के लिए एक निर्माण की प्रक्रिया की स्थापना के उनके आवेदन से संबंधित प्रकाशनों की बड़ी और बढ़ती संख्या के बावजूद माइक्रो इंजीनियरिंग विशेषज्ञों के लिए भी समय की काफी राशि लेता है; एक स्वीकार्य गुणवत्ता के स्तर की उपज के लिए विशिष्ट प्रयोगशाला वातावरण और micropost लेआउट के लिए अनुकूलन और अनुकूलन की आवश्यकता है कि कई प्रक्रिया कदम उठाए हैं।
वाणिज्यिक micropost सरणियों एक पहले से तैयार टी में अब उपलब्ध हैंएक लगातार उच्च गुणवत्ता के साथ ओ-उपयोग ("मुस्तैद") प्रारूप। जैसे वे साइट पर उत्पादन के लिए आवश्यक जटिल और लंबी निर्माण की प्रक्रिया के लिए एक विकल्प है। इस पत्र में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध micropost सरणी एक भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवि का उपयोग सेलुलर बलों मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह आलेख वर्णन करता है और इस पांडुलिपि के लिए अनुपूरक सामग्री के रूप में डाउनलोड के लिए उपलब्ध है जो MechProfiler नाम की एक पूरी तरह कार्यात्मक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, दस्तावेजों। सॉफ्टवेयर के एक सक्रिय रूप से बनाए रखा संस्करण भी http://www.orthobiomech.ethz.ch पर पाया जा सकता है।
एक "मुस्तैद" परख और एक संगत खुला स्रोत सॉफ्टवेयर विश्लेषण के संयोजन स्पष्ट रूप से सटीक TFM प्रयोगों को प्राप्त करने के लिए प्रवेश बाधा को कम करती है। साफ कमरे सुविधाओं या सॉफ्टवेयर विकास विशेषज्ञता या तो करने के लिए उपयोग के बिना शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक सेलुलर बलों का विश्लेषण कर सकते हैं। यह mechanos पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उपयोगकर्ता सक्षम बनाता हैensitivity परख उत्पादन के बजाय प्रौद्योगिकी ही है, और एक व्यापक समुदाय के लिए उपलब्ध कर्षण बल मापन करता है। इसके अलावा, इस micropost सरणियों की पूरी तरह से स्वचालित स्क्रीनिंग की ओर मार्ग प्रशस्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।
MechProfiler विश्लेषण सॉफ्टवेयर फ़ाइल स्वरूप झगड़ा, पीएनजी, बीएमपी और वालपेपर छवियों प्रक्रियाओं। छवियों प्रतिदीप्ति, चरण विपरीत या उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिया जा सकता है। स्टैंडअलोन कार्यक्रम (उपलब्ध है: चित्रा 12) मुक्त मैटलैब संकलक क्रम के साथ एक साथ चलाता है और अंतर्निहित एल्गोरिदम के बारे में 1 मिनट में एक या कई कोशिकाओं के साथ छवियों की प्रक्रिया करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है जो सुव्यवस्थित इमेज प्रोसेसिंग, के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, इन कोशिकाओं या तो रह जा सकता है या "निर्धारित"।
MechProfiler सॉफ्टवेयर बहुत गुणवत्ता वाणिज्यिक micropost सरणियों के reproducibility पर भरोसा करके डेटा विश्लेषण throughput बढ़ाने के लिए सक्षम है, और अधिक विशेष रूप से, डिफ़ॉल्ट & #8220; गैर हटाया हुआ "सरणी में प्रत्येक पद के पद के लिए एक स्मार्ट ग्रिड के खिलाफ माना जा सकता है (इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया सरणियों में ग्रिड के लिए विनिर्माण विचलन कम से कम 100 एनएम) थे।
कम एक में, हित के क्षेत्र के लिए उन्हें फसलों, विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइलों की एक चयन खोलता कोशिकाओं द्वारा कवर पदों को परिभाषित करता है या खारिज किए जाने की जरूरत है, जो पद पदों को निर्धारित करता है, विक्षेपण / आदर्श ग्रिड के खिलाफ सेना की गणना करता है, और अंत में एक मानक कार्यालय स्प्रेडशीट के लिए सहित, निर्यात के लिए एक संभावना के साथ सभी सेल विशिष्ट डेटा बचाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम काफी हद तक प्रवेश के लिए तकनीकी और व्यावहारिक बाधाओं को कम से कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र अग्रिम करने के लिए करना चाहता है। इन बाधाओं को दोनों पक्षों से आते हैं। और सबसे पहले reproducibly के नि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.
Materials
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: |
| pre-coated with Collagen I/Fibronectin | Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm | ||
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
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