Receptor Autoradiografie Protocol voor de gelokaliseerde Visualisatie van Angiotensine II-receptoren
Summary
Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Abstract
Dit protocol beschrijft receptor bindende patronen voor angiotensine II (Ang II) in de rattenhersenen met een radioligand specifiek voor Ang II receptoren receptor autoradiografische mapping uitvoert.
Weefselmonsters geoogst en opgeslagen bij -80 ° C. Een cryostaat wordt gebruikt om coronaalwaarts sectie van het weefsel (hersenen) en dooi-mount de secties op geladen dia's. De slide gemonteerde weefselcoupes worden uitgebroed in 125 I-SI-Ang II naar Ang II receptoren radioactief te merken. Aangrenzende glijbanen zijn gescheiden in twee groepen: "niet-specifieke binding (NSP) in aanwezigheid van een receptor verzadigende concentratie van niet- radioactief gemerkt Ang II, of een AT 1 Ang II receptor subtype (AT 1 R) selectieve angiotensine II receptorantagonist en 'totale binding' zonder AT 1 R antagonist. Een verzadigende concentratie van 2 Ang II receptor subtype (AT 2 R) antagonist (PD123319, 10 uM) is ook aanwezig in de incubatiop buffer te beperken 125 I-SI-Ang II binding aan de AT 1 R subtype. Gedurende een 30 min pre-incubatie bij ~ 22 ° C, NSP objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319 en losartan, terwijl 'de totale binding' objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319. Objectglaasjes worden vervolgens geïncubeerd met 125I-SI-Ang II in aanwezigheid van PD123319 voor 'totale binding' en PD123319 en losartan voor NSP in assay buffer, gevolgd door verscheidene "wassingen in buffer, water en zout en niet- verwijderen specifiek gebonden radioligand. Droog de glaasjes gebruikt blow-drogers, vervolgens blootgesteld aan autoradiografie film met een speciale folie en cassette. De film wordt ontwikkeld en de beelden worden gescand in een computer voor visuele en kwantitatieve densitometrie behulp van een eigen imaging-systeem en een spreadsheet. Een extra set van dia's worden thionine-gekleurd voor histologische vergelijkingen.
Het voordeel van autoradiografie receptor is de mogelijkheid om te visualiserenAng II receptoren in situ binnen een sectie van een weefselspecimen en anatomisch bepalen het gebied van het weefsel door het te vergelijken met een aangrenzend histologische referentiesectie.
Introduction
Hart- en vaatziekten nog steeds de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit in de Verenigde Staten, waardoor meer dan 30% van de sterfgevallen in de VS in 2011 1. De meest recente statistieken van de American Heart Association geven aan dat meer dan één op de drie mensen heeft één of meer typen van cardiovasculaire ziekte. Cardiovasculair onderzoek blijft stappen te maken tegen het begrijpen van deze ziekte, maar als de generaties beginnen ouder is het noodzakelijk om deze inspanningen voort te zetten. Het renine-angiotensine systeem (RAS) speelt een centrale rol in de regulatie van het cardiovasculaire systeem voornamelijk door het bevorderen atherosclerose, ontsteking, systemische vasoconstrictie en activatie van het sympathische zenuwstelsel (figuur 1) 2-8.
RAS is een hormonaal systeem dat wordt geactiveerd wanneer juxtaglomerulaire cellen in de nier scheiden renine in de bloedstroom in reactie op verlaagde bloeddruk, verhoogde sympathetic stimulatie, of verlaagd natrium stroom door de macula densa. Renine metaboliseert angiotensinogeen (gesynthetiseerd in de lever) op angiotensine I (Ang I) te vormen. Ang I wordt vervolgens gemetaboliseerd door angiotensine omzettend enzym (ACE), een ecto-enzym aan de luminale zijde van vasculaire endotheliale cellen, voornamelijk in de longen en de nieren, in angiotensine II (Ang II), de belangrijkste effector RAS peptide te vormen. Ang II kan activeren twee receptorsubtypen; type 1 receptor (AT 1 R) en type 2 receptor (AT 2 R), welke beide het cardiovasculaire systeem reguleren, onderhouden vocht en elektrolyten homeostase en wordt nu beschouwd als cognitieve functies en neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden verwerkt 8,9. Een lokale, brain-specifieke RAS wordt gemeld om zelfstandig te synthetiseren Ang II. In de hersenen, wordt het precursoreiwit angiotensinogen gesynthetiseerd in astroglia 10 omgezet Ang I een renine enzym 3, eventueel prorenin gebonden aan de receptor prorenin11, en vervolgens omgezet in Ang II-ACE die overvloedig op het extracellulaire oppervlak van neuronen tot expressie wordt gebracht in de hersenen 12. Dit intrabrain gegenereerd Ang II is de agonist voor de hersenen AT 1 en AT 2-receptoren die worden geïsoleerd uit bloed overgedragen Ang II.
Terwijl de AT 1 R een belangrijke fysiologische rol speelt, is beter bekend om de pathofysiologische effecten in het lichaam, vooral die de cardiovasculaire systeem en de nieren (afbeelding 2). Wanneer Ang II aan de AT 1 R bindt, veroorzaakt vasoconstrictie; toenemende weerstand tegen de bloedstroom en de bloeddruk te verhogen. Het bevordert ook de synthese en uitscheiding van aldosteron en vasopressine, leidt tot verhoogde natrium- en waterretentie. Deze effecten kunnen induceren ischemische hersenschade en cognitieve stoornissen die verband houdt met de ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer en Diabetes, alsmede zijn recent geïdentificeerd beïnvloeden leren en geheugen 13-15. Er is een terugkoppellus in het RAS, dat AT 1 R op de juxtaglomerulaire cellen in de nier remt renine secretie. Interessant is dat de AT 2 R algemeen tegen regelt de werking van AT 1 R, waardoor vasodilatatie, neurietuitgroei, axonale regeneratie, anti-proliferatie en cerebroprotection onder vele anderen 16-20. De AT 2 R is ook geïdentificeerd als een doelwit voor anti-hypertensie en recent, antikankergeneesmiddelen 21. Het bepalen van de lokalisatie en concentratie van Ang II receptoren in verschillende weefsels en hoe ze worden beïnvloed door verschillende behandelingen en ziektetoestanden met behulp van kwantitatieve densitometrische receptor autoradiografie helpt onthullen de rol speelt in de RAS specifieke ziekten.
Receptor autoradiografie is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een effectieve methode voor het aangeven van de aanwezigheid van angiotensine II receptoren en andere componenten van de RAS in de hersenen en andere weefsels van de rat, muis, cavia, hond en mens onder verschillende experimentele omstandigheden 22-34. Het belang van het vinden Ang II receptoren in de hersenen is dat één functionele neuroanatomy kunnen toepassen op de werking van angiotensine II in de hersenen, bijvoorbeeld de aanwezigheid van AT 1 R in de paraventriculaire kern van de hypothalamus (PVN) suggereert een functie van Ang II in de hersenen vasopressine, oxytocine of corticotropine releasing hormoon (CRH) afgifte of activering van het sympathische zenuwstelsel stimuleren. Aldus geneesmiddelen die de AT 1 R blokkeren kunnen sommige PVN gemedieerde effecten geassocieerd met overactiviteit van de hersenen RAS verlagen. Werk in uitvoering suggereert dat het gebruik van AT 1 R-antagonisten Post-Traumatische Stress Stoornis (PTSS) geïnduceerde afgifte van CRH kan verminderen en verbeteren van de symptomen van PTSS (Hurt et al., Ingediend voor publicatie). De PVN, subfornicaleorgel (SFO), en de amygdala zijn bekend voor de regulering van homeostase, honger / dorst, slaap, geheugen, emotionele reacties, en zijn de doelgebieden van deze demonstratie studie. Deze gebieden werden onderzocht door het verzamelen van coronale secties van hersenen op microscoopglaasjes, en behandelen van de secties met specifieke remmers samen met een specifiek radioligand voor Ang II receptoren. In deze studie, alle materialen en reagentia met voorgestelde leveranciers staan, jodium-125 werd gebruikt om een angiotensine II receptor antagonist, sarcosine 1, isoleucine 8 Ang II (SI Ang II), dat vervolgens werd gezuiverd zoals de mono 125I radioactief te -SI Ang II onder toepassing van HPLC methodes zoals eerder 35 beschreven. Het gebruik van deze hoge specifieke activiteit radioligand maakt de visualisatie van gebieden van lage, matige en hoge receptordichtheid na blootstelling van de radioactief gemerkte secties röntgenfilm. Door het kalibreren van de film met de hersenen plakken normen die bekende hoeveelheden jodium-125, het specifieke bedragvan Ang II receptor binding in een gebied kunnen worden gekwantificeerd. In experimentele studies, kunnen de angiotensine II receptor binding in de hersenen van proefpersonen worden vergeleken met die in de hersenen van controlepersonen. Dit kan aangeven of het optreden van Ang II worden gewijzigd als reactie op een genetische aandoening, fenotypische afwijking, ziekte of behandeling met geneesmiddelen. Deze kennis kan vervolgens worden toegepast op de ontwikkeling van therapieën voor ziekten geassocieerd met ontregeling van het RAS behandelen. Alternatieve technieken receptorbindingsplaatsen identificeren, maar met beperkte anatomische resolutie, bindingsonderzoeken die weefselmembraan preparaten uit weefsel homogenaten, die zijn geïncubeerd met het radioligand over een bereik van concentraties radioligand bindingsaffiniteit als de dissociatieconstante beoordelen gebruiken (KD ) en maximaal bindingsvermogen (B max) van het weefsel van belang.
De hier beschreven protocol kunnen worden onderverdeeld in 5 grote components: Het voorbereiden van coupes voor Receptor Autoradiography; Receptor Autoradiografie; Film belichting en ontwikkeling; histologie; en Densitometrische Image Analysis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschreven identificeert de visualisatie van "totale" en "niet-specifieke" binding van de radioligand in aangrenzende secties van coronale secties van een knaagdierhersenen eerder geoogst en opgeslagen bij -80 ° C, en kan goed toepasbaar op vrijwel elk weefsel dat heeft anatomisch opgelost substructuren die differentiële bedragen van receptoren of radioligand bindende websites. De beschreven binnen het protocol procedures zijn eenvoudig en de analyse is van cruciaal belang voor de juis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grant HL-113905
Materials
| 500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
- Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U., Ganong, W. F., Martini, L. . Frontiers in Neuroendocrinology. , 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
- Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W., Wang, D. H. . Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. , 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).
