JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Рецептор Авторадиография Протокол о локализованного визуализации ангиотензина II Рецепторы

Published: June 07, 2016
doi:
10.3791/53866
, , ,
1Farquhar College of Arts and Sciences,Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Nova Southeastern University, 3School of Medicine,University of Colorado

Summary

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Abstract

Этот протокол описывает связывание рецептора шаблоны для ангиотензина II (Ang II) в головном мозге крысы с использованием радиолиганда, специфичного для рецепторов Ang II для выполнения рецептора авторадиографического отображение.

Тканевые образцы собирают и хранят при -80 ° С. Криостат используется для коронковой секции ткани (мозг) и оттепели монтажа секций на заряженных горками. Срезы ткани слайд монтажа инкубируют в 125 I-SI-Ang II к радиоактивной рецепторов Ang II. Прилегающие слайды разделены на две группы: 'неспецифического связывания' (NSP) в присутствии насыщающей концентрации рецепторов не-меченного Ang II, или АТ 1 рецепторов подтипа Ang II (AT 1 R) селективный антагонист рецептора АТ II и 'не общего связывания' без AT 1 антагониста R. Концентрация насыщающего АТ 2 подтипа рецептора Ang II (АТ 2 R) антагонист (PD123319, 10 мкМ) также присутствует в incubatiна буфер для ограничения 125 I-SI-Ang II связывание с AT 1 R подтипа. В течение 30 мин предварительной инкубации при ~ 22 ° C, NSP горок подвергаются 10 мкМ PD123319 и лозартана, в то время как 'общего связывания' горок подвергаются 10 мкМ PD123319. Слайды затем инкубируют с 125 I-SI-Ang II в присутствии PD123319 для общего уровня связывания », и PD123319 и лозартан для NSP в буфере для анализа, а затем несколько« стирок »в буфере, и воду , чтобы удалить соль и не- специфически связанного радиолиганда. Слайды сушат с использованием выдувного сушилки, затем подвергали авторадиографии пленки с использованием специализированной пленки и кассеты. Фильм разработан и изображения сканируются в компьютер для визуального и количественного денситометрии с использованием собственной системы обработки изображений и электронных таблиц. Дополнительный набор слайдов тионин окрашенных гистологических сравнений.

Преимущество использования авторадиографии рецептора является возможность визуализироватьАнг рецепторов II в месте, в пределах участка тканевого образца, а также анатомически определить область ткани, сравнивая его с соседней гистологического справочном разделе.

Introduction

Сердечно – сосудистые заболевания по- прежнему является ведущей причиной смерти и инвалидности в Соединенных Штатах, в результате чего более 30% смертельных случаев в США в 2011 году 1. Самые последние статистические данные из Американской ассоциации сердца показывают , что более чем один человек в трех имеет один или более тип сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые исследования продолжают добиваться успехов в отношении понимания этой болезни, но, как поколения начинают стареть крайне важно продолжать эти усилия. Система ренин-ангиотензин (RAS) , играет центральную роль в регуляции сердечно – сосудистой системы , в первую очередь путем продвижения атеросклероза, воспаления, системную вазоконстрикцию и активацию симпатической нервной системы (рис 1) 2-8.

РАН является гормональная система, которая активируется, когда юкстагломерулярной клетки почки выделяют ренин в кровоток в ответ на снижение артериального давления, увеличение sympathetic стимуляция или снижение потока натрия с помощью макулы Densa. Ренин усваивает ангиотензиноген (синтезированного в печени) с образованием ангиотензина I (Ang I). Анг я затем метаболизируется ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), в ectoenzyme на просвете стороне клеток эндотелия сосудов, в первую очередь в легких и почках, с образованием ангиотензина II (анг II), главный эффекторный пептид РАН. Анг II способен активировать два подтипа рецепторов; рецептор типа 1 (AT 1 R) и рецептор типа 2 (AT 2 R), и которые регулируют сердечно – сосудистой системы, поддержания жидкости и электролитов гомеостаз и в настоящее время считаются влияют на когнитивные функции и нейродегенеративные заболевания процессов 8,9. Местный, специфичная для головного мозга РАН сообщается самостоятельно синтезировать Ang II. В головном мозге, белок – предшественник ангиотензин синтезируется в астроглию 10 обращенных к Ang I с помощью ренин-подобный фермент 3, возможно , проренина , связанный с рецептором проренина11, а затем превращают в Ang II ангиотензин-превращающего фермента , который в большом количестве экспрессируется на внеклеточной поверхности нейронов в головном мозге 12. Это intrabrain генерируется Ang II является агонистом для мозга АТ 1 и АТ 2 рецепторов, которые изолированы от передающейся через кровь Ang II.

В то время как AT 1 R играет важную физиологическую роль, она лучше известна своими патофизиологические эффекты по всему телу, в первую очередь влияет на сердечно – сосудистую систему и почки (рисунок 2). Когда Ang II связывается с AT 1 R, он вызывает вазоконстрикцию; повышение устойчивости к кровотока и повышение кровяного давления. Он также стимулирует синтез и секрецию альдостерона и вазопрессина, что приводит к увеличению задержки натрия и воды. Эти эффекты могут также вызвать ишемического повреждения головного мозга и когнитивных нарушений и связана с болезнью Паркинсона, болезнь Альцгеймера, и diabeTES, а также будучи недавно идентифицированы влиять на обучение и память 13-15. Существует петля обратной связи в РАН в том , что AT 1 R на юкстагломерулярных клеток в почках ингибирует секрецию ренина. Интересно отметить , что AT 2 R , как правило против регулирует действие AT 1 R, вызывая вазодилатацию, невритов, регенерацию аксонов, анти-пролиферацию и cerebroprotection среди многих других 16-20. AT 2 R также была определена в качестве мишени для анти-гипертензии и в последнее время , противораковых препаратов 21. Определение локализации и плотности рецепторов Ang II в пределах различных тканей и как они подвергаются воздействию различных методов лечения и болезненных состояний с использованием количественного денситометрическую авторадиографии рецептора поможет раскрыть роль РАН играет в конкретных заболеваний.

Рецептор радиоавтография был использован на протяжении более 30 лет в качестве эффективного метода для индикации присутствия ангиотензина II рецепторы и другие компоненты РАН в головном мозге и других тканях крысы, мыши, морской свинки, собаки и человека при различных экспериментальных условиях 22-34. Важность определения местоположения рецепторов Ang II в мозге является то , что можно применить функциональную нейроанатомии к действиям Ang II в головном мозге, например, присутствие AT 1 R в паравентрикулярной ядре гипоталамуса (PVN) предлагает функцию Ang II в головном мозге, чтобы стимулировать вазопрессин, окситоцин или рилизинг гормон (CRH) релиз, или активацию симпатической нервной системы. Таким образом, препараты , которые блокируют AT 1 R может уменьшить некоторые из этих PVN-опосредованных эффектов , связанных с за деятельностью мозга РАН. Работа в прогрессе предполагает , что применение антагонистов AT 1 R может уменьшить посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) -индуцированное высвобождение КРГ и смягчить симптомы ПТСР (Hurt и др., Который был представлен для публикации). PVN, subfornicalорган (SFO), и миндалина известны для регуляции гомеостаза, аппетит / жажда, сон, память, эмоциональные реакции, и являются целевыми направлениями этого демонстрационного исследования. Эти регионы были исследованы путем сбора Коронарные срезы головного мозга на предметные стекла микроскопа, и обрабатывать участки с специфическими ингибиторами наряду со специфическим радиолиганда для рецепторов Ang II. В этом исследовании все материалы и реагенты и способы их поставщиков перечислены, Йод-125 был использован для радиоактивной антагонист Ang II рецептора, саркозина 1, изолейцин 8 Ang II (SI Ang II), который затем очищали , как моно 125 I -SI АТ II с использованием методов ВЭЖХ , как описано ранее 35. Использование этой высокой удельной активности радиоактивного лиганда позволяет визуализировать зоны с низкой, средней и высокой плотности рецепторов после воздействия на радиоактивно меченных участков с рентгеновской пленкой. Путем калибровки пленку со стандартами мозга пасты, содержащей известное количество йода-125, конкретные суммыангиотензина II связывания рецепторов в области может быть определена количественно. В экспериментальных исследованиях, рецептор Ang II связывание в мозге испытуемых можно сравнить с, что в мозге контрольных субъектов. Это может указать, является ли изменены действия Ang II в ответ на генетическое состояние, фенотипические аномалии, болезненного состояния или медикаментозного лечения. Это знание может быть применен к разработке методов лечения для лечения заболеваний, связанных с нарушением регуляции РАН. Альтернативные методы , которые идентифицируют рецептор сайты связывания, но с уменьшенной анатомической разрешением, являются обязательными для анализов , которые используют мембранные препараты тканей , полученных из гомогенатов тканей, которые инкубируемых с меченым лигандом в диапазоне концентраций с целью оценки связывания радиолиганда сродством как константа диссоциации (K D ) и максимальная связывающая способность (в макс) интересующей ткани.

Протокол, описанный здесь, может быть разбита на 5 основных сотрудничестваmponents: Готовимся Tissue Разделы для рецептора авторадиографии; Рецептор Авторадиография; Фильм экспозиции и развития; гистологии; и Денситометрический анализ изображений.

Protocol

Все процедуры на животных , проведенные для данного исследования были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Нова Юго – Восточного университета по в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, 8 – е издание (Национальная академии Press, Вашингтон, округ…

Representative Results

Обзор метаболического пути ренин-ангиотензин системы показана на рисунке 1 и прямой акцент на подтипы рецепторов ангиотензина II (AT 1 R и AT 2 R) описывается на рисунке 2. Рисунок 3 показывает передачу корональной мозга разделы на пред…

Discussion

Описанный протокол идентифицирует визуализацию 'Total' и 'неспецифический' связывания радиолиганда в смежных участках корональных секций грызуна мозга ранее заготовленной и хранили при -80 ° С, и может быть легко применимы к практически в каждой ткани, имеет анатомически решен по…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH Grant HL-113905

Materials

500ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24mm x 60mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24x30cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8×11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep / OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U., Ganong, W. F., Martini, L. . Frontiers in Neuroendocrinology. , 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W., Wang, D. H. . Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. , 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain SectionsQuantificationLocalizationNeurodegenerative DiseasesCardiovascular DiseasesHormone Receptor SystemsDrugs Of AbuseCryostat SectioningMicroscope SlidesRadio LabelingNon-specific TreatmentTotal Treatment
check_url/53866?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image