Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Este protocolo descreve os padrões de ligação do receptor de angiotensina II (Ang II) no cérebro de rato usando um radioligando específica para os receptores de Ang II para executar o mapeamento do receptor de auto-radiografia.
Os espécimes de tecido são colhidas e armazenadas a -80 ° C. A criostato é usado para a secção coronal do tecido (cérebro) e descongelar-montar as secções em lâminas carregadas. As secções de tecido em lâminas são incubadas em 125I-SI-Ang II para marcar radioactivamente receptores de Ang II. Lâminas adjacentes são separados em dois conjuntos: "ligação não específica" (NSP) na presença de uma concentração saturante de receptores de não-marcado radioactivamente Ang II, ou um subtipo AT 1 do receptor de angiotensina II (AT 1 R) antagonista selectivo do receptor Ang II e 'ligação total ", sem AT 1 antagonista R. Uma concentração saturante de AT 2 subtipo do receptor Ang II (2R) antagonista (PD123319, 10 uM) também está presente no incubatiem tampão de limitar 125I-SI-Ang II se ligarem ao subtipo AT 1 R. Durante 30 min de pré-incubação à temperatura de ~ 22 ° C, as lâminas NSP são expostas a 10? M e PD123319 losartan, enquanto 'ligação total "slides são expostas a 10? M PD123319. As lâminas são então incubadas com 125 I-Si-Ang II, na presença de PD 123319 para 'ligação total ", e PD 123319 e de losartan para PEN em tampão de ensaio, seguido de várias lavagens' 'em tampão, e água para remover o sal e não- radioligando especificamente ligado. As lâminas são secas com secador por, em seguida, exposto a filme de auto-radiografia usando um filme especializada e cassete. O filme é desenvolvido e as imagens são digitalizadas em um computador para densitometria visual e quantitativa usando um sistema de imagem proprietária e uma planilha. Um conjunto adicional de slides são tionina-coradas para comparações histológicas.
A vantagem de utilizar a autorradiografia do receptor é a capacidade de visualizarAng II receptores in situ, dentro de uma secção de uma amostra de tecido, e anatomicamente identificar a região do tecido por comparação desta com uma secção histológica de referência adjacente.
A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte e incapacidade nos Estados Unidos, causando mais de 30% das mortes em os EUA em 2011 1. As estatísticas mais recentes da American Heart Association indicam que mais de uma em cada três pessoas tem uma ou mais tipos de doenças cardiovasculares. pesquisa cardiovascular continua a fazer progressos contra a compreensão desta doença, mas como as gerações começam a envelhecer, é imperativo para continuar esses esforços. O sistema renina-angiotensina (RAS) desempenha um papel central na regulação do sistema cardiovascular, principalmente através da promoção da aterosclerose, a inflamação, a vasoconstrição sistémica, e a activação do sistema nervoso simpático (Figura 1) 2-8.
O RAS é um sistema hormonal que é activada quando as células justaglomerulares do rim secretam renina na corrente sanguínea em resposta à diminuição da pressão sanguínea, aumento sympatestimulação hetic, ou diminuição do fluxo de sódio pela mácula densa. A renina metaboliza o angiotensinogénio (sintetizado no fígado) para formar a angiotensina I (Ang I). Ang I é então metabolizado pela enzima conversora de angiotensina (ACE), uma ectoenzima no lado luminal das células endoteliais vasculares, principalmente nos pulmões e rins, para formar angiotensina II (Ang II), o péptido de efector principal do RAS. Ang II é capaz de activar dois subtipos de receptores; o receptor de tipo 1 (AT1 R) e o receptor de tipo 2 (AT 2 R), tanto que regulam o sistema cardiovascular, manter a homeostase de fluidos e eletrólitos e agora são considerados para afetar a função cognitiva e doença neurodegenerativa processa 8,9. A RAS local, específica do cérebro é relatado para sintetizar de forma independente Ang II. No cérebro, o angiotensinogénio proteína precursora é sintetizado de astroglia 10 convertido a Ang I por uma enzima renina-3 como, possivelmente, a pro-renina ligado ao receptor de pro-renina11, e, subsequentemente, convertida em angiotensina II pela enzima conversora de angiotensina que é abundantemente expresso na superfície extracelular de neurónios no cérebro 12. Este intrabrain gerado Ang II é o agonista para o cérebro AT 1 e AT 2 receptores que são isoladas a partir de sangue-carregada de Ang II.
Enquanto o NO desempenha um R um importante papel fisiológico, é melhor conhecida pelos seus efeitos patofisiológicos de todo o corpo, que afecta principalmente o sistema cardiovascular e nos rins (figura 2). Quando a Ang II liga-se a AT 1 R, que provoca vasoconstrição; aumento da resistência ao fluxo sanguíneo e aumentar a pressão sanguínea. Além disso, promove a síntese e secreção de aldosterona e vasopressina, levando ao aumento da retenção de sódio e água. Estes efeitos podem também induzir a lesão cerebral isquémica e deficiências cognitivas e está ligada à doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e diabetes, bem como a ser recentemente identificado para afectar de aprendizagem e de memória 13-15. Há um ciclo de feedback no RAS em que a AT 1 R nas células justaglomerulares no rim inibe a secreção de renina. Curiosamente, o NO 2 R geralmente contra-regula a acção de pelo 1R, causando vasodilatação, o crescimento de neurites, a regeneração axonal, anti-proliferação e cerebroprotection entre muitos outros 16-20. O NO 2 R também foi identificado como um alvo para anti-hipertensão e, recentemente, drogas anti-câncer 21. Determinar a localização e densidade de receptores de Ang II no prazo de vários tecidos e como eles são influenciados por diversos tratamentos e estados de doença, utilizando auto-radiografia receptor densitometria quantitativa irá ajudar a descobrir o papel que o RAS desempenha nas doenças específicas.
Autorradiografia do receptor foi usado há mais de 30 anos como um método eficaz para a indicação da presença de angiotensina II receptores e outros componentes do RAS no cérebro e outros tecidos do rato, murganho, cobaia, cão e ser humano sob uma variedade de condições experimentais 22-34. A importância de localizar receptores de Ang II no cérebro é que se pode aplicar neuroanatomy funcional para as acções de Ang II no cérebro, por exemplo, a presença de pelo um de R no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) sugere uma função de Ang II no cérebro para estimular a vasopressina, a oxitocina ou libertação da hormona de libertação de corticotropina (CRH), ou a activação do sistema nervoso simpático. Assim, as drogas que bloqueiam a AT 1 R pode diminuir alguns destes efeitos PVN mediadas associados com relação à actividade das RAS cerebrais. Trabalhos em curso sugere que o uso de AT 1 antagonistas R pode diminuir Stress Disorder (PTSD) a libertação induzida pós-traumático de CRH e melhorar os sintomas de PTSD (ferir et al., Submetido para publicação). O PVN, subfornicialórgão (SFO), e na amígdala são conhecidas por regular a homeostase, o apetite / sede, sono, memória, reações emocionais, e são as áreas-alvo deste estudo demonstração. Estas regiões foram examinados através da recolha de secções coronais de cérebro em lâminas de microscópio, e o tratamento das secções com inibidores específicos, juntamente com um ligando radioactivo específico para receptores de Ang II. Neste estudo, todos os materiais e reagentes juntamente com os fornecedores sugeridas são listados, Iodo-125 foi utilizado para radiomarcar um antagonista de angiotensina II receptor, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), que foi depois purificado como o mono 125I -Si Ang II utilizando métodos de HPLC conforme descrito anteriormente 35. O uso desta elevada actividade específica de radioligando permite a visualização de áreas de baixa, moderada e alta densidade de receptor após a exposição das secções radiomarcado a um filme de raios-x. Ao calibrar o filme com os padrões de pasta cerebrais que contenham quantidades conhecidas de iodo-125, a quantidade específicaAng II de ligação ao receptor em uma área pode ser quantificada. Em estudos experimentais, o receptor de Ang II de ligação nos cérebros de sujeitos experimentais pode ser comparada com a no cérebro de indivíduos de controlo. Isto pode indicar se as acções de Ang II são alteradas em resposta a uma condição genética, anormalidade fenotípica, estado de doença ou de tratamento da droga. Este conhecimento pode, então, ser aplicada ao desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da RAS. As técnicas alternativas que a identificação de sítios de ligação ao receptor, mas com uma resolução reduzida anatómica, são ensaios que utilizam preparações de membrana de tecidos derivadas de homogenatos de tecidos, as quais são incubadas com o radioligando ao longo de uma gama de concentrações a fim de avaliar a afinidade de ligação de radioligandos como a constante de dissociação (Kd de ligação ) e capacidade de ligação máxima (B max) do tecido de interesse.
O protocolo aqui descrito pode ser dividido em 5 dos principais components: Preparando secções de tecido para o receptor autorradiografia; Receptor autorradiografia; Exposição de Cinema e Desenvolvimento; Histologia; Análise de Imagem e densitométrica.
O protocolo descrito identifica a visualização de "total" e "não específica" de ligação do radioligando em secções adjacentes de secções coronais de cérebro de roedor anteriormente colhido e armazenado a -80 ° C, e pode ser facilmente aplicável a virtualmente todos os tecidos que tem anatomicamente resolvido subestruturas que mostram quantidades diferenciais de receptores ou locais de ligação de radioligandos. Os procedimentos descritos no âmbito do protocolo são simples e a análise…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH Grant HL-113905
500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
Photo flo | Kodak | 1464502 | |
Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
NaCl | Fisher | S271 | |
Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
Permount | Fisher | SP15-100 | |
PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
Thionin | Fisher | T409-25 | |
X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL |