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Neuroscience

アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

Published: June 07, 2016
doi:
10.3791/53866
, , ,
1Farquhar College of Arts and Sciences,Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Nova Southeastern University, 3School of Medicine,University of Colorado

Summary

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Abstract

このプロトコルは、受容体オートラジオグラフィーマッピングを実行するためのAng II受容体に特異的な放射性リガンドを用いて、ラット脳におけるアンジオテンシンII（アンギオテンシンII）の受容体結合パターンを説明しています。

組織標本を採取し、-80℃で保存します。クライオスタットは、冠状セクションに組織（脳）を使用し、帯電したスライド上のセクションをマウント解凍します。スライドに取り付けられた組織切片は、アンギオテンシンII受容体を放射標識するために125 I-SI-アンギオテンシンII中でインキュベートします。受容体飽和の非放射性標識アンギオテンシンIIの濃度、または（1 R AT）AT 1アンギオテンシンII受容体サブタイプ選択的なアンギオテンシンII受容体アンタゴニストの存在下で、「非特異的結合」（NSP）、隣接するスライドを2つのセットに分離されています、ノーAT 1 Rアンタゴニストと「総結合」。 AT 2の飽和濃度（2 R AT）アンギオテンシンIIレセプターサブタイプ拮抗薬（PD123319、10μM）もincubati中に存在しますバッファにAT 1 Rサブタイプに結合する125 I-SI-アンギオテンシンIIを制限します。スライド10μMのPD123319にさらされている」結合は合計「ながら〜22℃で30分間のプレインキュベーションの間に、NSPのスライドは、10μMのPD123319およびロサルタンにさらされています。次いで、スライドを「全結合」、およびPD123319およびアッセイ緩衝液中のNSPのためのロサルタン、塩を除去するために、いくつかのバッファ内の「洗浄液」、そして続いて水と非ためのPD123319の存在下で、125 I-SI-アンギオテンシンIIと共にインキュベートします特異的に結合した放射性リガンド。次いで、スライドを、特殊なフィルムとカセットを使用して、オートラジオグラフィーフィルムに露光ブロードライヤーを使用して乾燥させます。フィルムは現像され、画像が独自のイメージングシステムとスプレッドシートを使用して、視覚的および定量的デンシトメトリーのためにコンピュータにスキャンされています。スライドの追加セットは、組織学的比較のためチオニン染色されています。

受容体オートラジオグラフィーを使用する利点は、視覚化する能力でありますアンギオテンシンII組織標本のセクション内のインサイツの受容体、および解剖学的には、隣接する組織の基準セクションと比較することによって組織の領域を特定します。

Introduction

心血管疾患は2011年1米国における死因の30％以上を引き起こし、米国における死亡および障害の主要な原因であり続けています。米国心臓協会からの最新の統計が3で複数の人が1を持っていることを示しています心血管疾患の種類以上。心血管研究は、この疾患の理解に対して、引き続き注力していきますが、世代が高齢になっ始めると、これらの努力を継続することが不可欠です。レニン-アンギオテンシン系（RAS）は、主として、アテローム性動脈硬化症、炎症、全身の血管収縮、交感神経系の活性化（ 図1）2-8 を促進することによって、心血管系の調節において中心的な役割を果たしています。

RASは、腎臓の傍糸球体細胞は、血圧の減少に応答して血流中にレニンを分泌するときに活性化されるホルモン系、増加sympatありますhetic刺激、または黄斑緻密によってナトリウムの流れを減少させました。レニンは、アンジオテンシンI（アンI）を形成する（肝臓で合成された）アンジオテンシノーゲンを代謝します。アンギオテンシンIは、次いで、アンジオテンシンII（ANG II）、RASの主要なエフェクターペプチドを形成するために、主に肺および腎臓で、血管内皮細胞の管腔側に、アンジオテンシン変換酵素（ACE）によって外酵素が代謝されます。アンギオテンシンIIは、2つの受容体サブタイプを活性化することができます。 （1 AT R）タイプ1受容体及び（2 R AT）2型受容体は、心臓血管系を調節する両方、体液および電解質の恒常性を維持し、現在、認知機能および神経変性疾患に影響を与えると考えられている8,9を処理します。局所脳特異RASは、独立して、アンギオテンシンIIを合成することが報告されています。脳では、前駆体タンパク質アンギオテンシノーゲンはレニンのような酵素3によってアンギオテンシンIに変換アストログリア10で合成され、おそらくはプロレニンプロレニン受容体に結合しました11、その後豊富脳12内のニューロンの細胞外表面上に発現されたアンジオテンシン変換酵素によってアンギオテンシンIIに変換されます。アンギオテンシンII生成されたこのintrabrainは1 AT脳および血液由来のAng IIから隔離されている2受容体でアゴニストです。

AT 1 Rは、重要な生理学的役割を果たしているが、それはより良い、主に心臓血管系及び腎臓（ 図2）に影響を与える、体全体にその病態生理学的効果のために知られています。アンギオテンシンIIは、AT 1 Rに結合すると、それは血管収縮を引き起こします。血流に対する抵抗性を増加させ、血圧を上昇させます。それはまた、増加したナトリウムおよび水の保持をもたらす、アルドステロンおよびバソプレシンの合成および分泌を促進します。これらの効果はまた、虚血性脳損傷および認知機能障害を誘発することができ、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびdiabeに連結されていますTES、並びに、最近学習および記憶13-15に影響を与えることが同定されています。レニン分泌を抑制し、腎臓での傍糸球体細胞に1 R ATという点で、RASでフィードバックループがあります。興味深いことに、AT 2 Rは、一般的に血管拡張、神経突起伸長、軸索再生、抗増殖、および他の多くの間で脳保護16-20を引き起こし、1 R ATの行動を反調節します。 AT 2 Rは、抗高血圧、最近、抗がん剤21のための標的として同定されています。様々な組織内のAng II受容体の局在化および密度を決定し、それらがどのように定量的デンシトメトリー受容体オートラジオグラフィーを用いた各種トリートメントや病気の状態によって影響を受けることはRASが特定の疾患に果たす役割を明らかにするのに役立ちます。

受容体オートラジオグラフィーは、アンジオテンシンIの存在を示すための有効な方法として、30年以上にわたって使用されていますI受容体と脳内のRASの他の構成要素および実験条件22-34の様々な下ラット、マウス、モルモット、イヌおよびヒトの他の組織。脳内のAng II受容体の位置を特定することの重要性は、一つは、脳内でのAng IIのアクションに例えば機能的な神経解剖学を適用することができるということである、視床下部の室傍核におけるAT 1 R（PVN）の存在は、アンの機能を示唆しています脳内のIIは、バソプレッシン、オキシトシンまたは副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）のリリース、または交感神経系の活性化を刺激します。したがって、AT 1 Rをブロックする薬は、脳のRASの活動の上に関連したこれらのPVN媒介効果のいくつかを低下させる可能性があります。進行中の作業は1 RアンタゴニストATの使用はCRHの心的外傷後ストレス障害（PTSD）誘導放出を減少させ、PTSDの症状を改善することができることを示唆している（ハートら 、出版のために提出します）。 PVN、弓器官（SFO）、および扁桃体がホメオスタシス、食欲/渇き、睡眠、記憶、感情的反応を調節するために知られており、この実証研究の対象領域です。これらの領域は、顕微鏡スライド上に脳の冠状切片を収集し、およびAng II受容体に特異的な放射性リガンドと共に特異的阻害剤で切片を処理することにより調べました。本研究では、提案したベンダーと一緒にすべての材料および試薬は記載されている、ヨウ素125は、その後、モノ125 Iのようにして精製したアンギオテンシンII受容体拮抗薬、サルコシン1、イソロイシン8のAng II（SIのAng II）を、放射性標識するために使用されたされています以前に35記載のようにHPLC法を用いて-SIのAng II。この高い比活性の放射性リガンドの使用は、X線フィルムへの放射性標識部分の露光後に、低中程度および高い受容体密度の領域の可視化を可能にします。ヨウ素125、特定量の既知量を含む脳ペースト規格にフィルムを校正することにより、領域に結合アンギオテンシンII受容体を定量することができます。実験的研究では、実験対象の脳に結合アンギオテンシンII受容体は、対照被験者の脳におけるものと比較することができます。これはアンギオテンシンIIの作用は、遺伝的状態、表現型の異常、疾患状態または薬物療法に応答して変更されているかどうかを示すことができます。この知識は、その後、RASの調節不全に関連する疾患を治療するための治療法の開発に適用することができます。代替的な受容体結合部位を同定する技術が、低減解剖学的解像度で、解離定数（K Dとしての放射性リガンド結合親和性を評価するために、濃度の範囲にわたって放射性リガンド組織ホモジネート由来の組織の膜調製物を使用する結合アッセイであります目的の組織の）および最大結合能（B max）が。

ここで説明するプロトコルは、大きく5つの共同に分けることができますmponents：受容体オートラジオグラフィーのための組織切片を準備します。受容体オートラジオグラフィー;フィルムの露光、現像、組織学;そして、濃度測定の画像解析。

Protocol

この研究のために行うすべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針に従ってにノバサウスイースタン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された、 第 8版（国立アカデミープレス、ワシントン、DC、2011 ）。 受容体オートラジオグラフィーのために1.準備組織切片犠牲時に、収穫の新鮮な脳組織、できるだけ早く-20℃の冷凍庫にアルミ箔と場所で?…

Representative Results

レニン-アンギオテンシン系の代謝経路の概要を、図1に示されており、アンジオテンシンII受容体サブタイプ（1 R ATおよび2 R AT）への直接的な焦点は、図2に記載されている。3ディスプレイ冠状脳の転送図 図4に見られるように、所定の125 I-シャンII濃度を用いて受容体…

Discussion

説明されたプロトコルは、齧歯類脳以前に採取し、-80℃で保存の冠状切片の隣接するセクションでの放射性リガンドの結合を「合計」及び「非特異的」の視覚化を識別し、実質的にすべての組織に容易に適用することができること解剖学的に受容体または放射性リガンド結合部位の差分量を表示する下部構造を解決しました。プロトコル内で説明する手順は簡単で、分析は結果を正しく解釈?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH Grant HL-113905

Materials

500ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24mm x 60mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24x30cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8×11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep / OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL
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Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).
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