Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Bu protokol Ang II reseptörleri reseptör otoradyografik haritlama özgü bir radyo-kullanarak sıçan beyninde Anjiotensin II (Ang II) için reseptör bağlanma şekilleri ile ilgili bilgiler.
Doku numuneleri hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklanır. Bir kriyostat koronal bölümüne doku (beyin) kullanılır ve yüklü slaytlar üzerine bölümleri monte çözdürmeyiniz. Slayt monte doku bölümleri Ang II reseptörlerinin radyolabel 125I-sı-Ang II içerisinde inkübe edilir. Komşu slaytlar iki kümeye ayrılır: bir alıcı doyurarak radyo-etiketlenmemiş Ang II konsantrasyonu ya da varlığında (MGP) 'spesifik olmayan bağlanmayı' 1, Ang II reseptörü alttipinin (1 r) seçici Ang II reseptör antagonisti ve 1 R antagonisti AT hiçbir ile 'bağlayıcı toplamı'. 2, Ang II reseptörü alttipinin (2'de R) doyurucu konsantrasyonu antagonisti (PD123319, 10 uM), aynı zamanda kuluçkalamadan mevcutturtampon üzerinde AT 1 R alt tipine bağlama 125l-SI-Ang II sınırlamak için. 22 ° C, MGP slaytlar 10 uM PD123319 ve losartan maruz ° 'de 30 dakikalık bir ön inkübasyon sırasında, slaytlar 10 uM PD123319 maruz' bağları, toplam 'ise. Slaytlar, sonra 'toplam bağlanma için' PD123319 mevcudiyetinde 125l-sı-Ang II ile inkübe edildi ve analiz tamponu içinde MGP için PD123319 ve losartan, birkaç 'yıkama ", ardından tampon maddesi içinde ve su tuzunu ve non-kaldırmak edilir spesifik olarak bağlanmış radyoligandı. slaytlar uzmanlaşmış bir film ve kaset kullanarak ardından otoradyografi filmine maruz darbe kurutucular kullanılarak kurutulur. Film geliştirilen ve görüntüler, özel bir görüntüleme sistemi ve elektronik tablo kullanarak görsel ve kantitatif dansitometri için bir bilgisayara taranır. slaytlar ek olarak bir dizi histolojik karşılaştırmalar için tionin-boyanır.
reseptör otoradyografi kullanmanın avantajı görselleştirmek yeteneğiAng II, bir doku numunesinin bir bölümü içinde yerinde reseptörler, anatomik bir bitişik histolojik bir referans bölümüne karşılaştırarak doku bölgesini tanımlamak.
Kardiyovasküler hastalık 2011'de 1 ABD'de ölümlerin% 30'undan fazlasını neden ABD'de ölüm ve sakatlık, önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Amerikan Kalp Derneği en son istatistikler üç birden fazla kişi birine sahip olduğunu göstermektedir kardiyovasküler hastalık ya da daha fazla türü. Kardiyovasküler araştırmalar bu hastalığı anlamak karşı adımlar atmaya devam ediyor, ancak kuşaklar yaşlanıyor başlarken çabalarına devam etmesi zorunludur. Renin-anjiyotensin sistemi (RAS), esas (Şekil 1), 2-8, sempatik sinir sisteminin ateroskleroz, enflamasyon, sistemik vazokonstriksiyon ve aktivasyonunu teşvik ederek kalp-damar sistemi regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır.
RAS tansiyon azalan böbrek jukstaglomerüler hücreleri yanıt olarak kan dolaşımına renin salgılayan aktive bir hormonal sistem, sympat arttıinfographie stimülasyon veya makula densa sodyum akışını azalmıştır. Renin anjiyotensin I (Ang I) 'in (karaciğerde sentezlenir) anjiyotensinojen metabolizması için önemlidir. Ang sonra anjiyotensin II (AngII), RAS ana efektör peptit oluşturmak için, birincil akciğer ve böbrekte, vasküler endotel hücrelerinin luminal tarafta, anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) tarafından ectoenzyme metabolize edilir. Ang II İki reseptör alt tipi aktive edebilen olduğu; (1 AT R) tip 1 reseptör ve (2 R AT) tip 2 reseptör, kardiyovasküler sistem düzenleyen hem de sıvı ve elektrolit homeostazisini korumak ve şimdi bilişsel işlev ve nörodejeneratif hastalığı etkilediği düşünülmektedir 8,9 işler. Yerel, beyin özel RAS bağımsız Ang II sentezlenmesi için bildirilmektedir. Beyinde, ön-madde proteini anjiyotensinojen bir renin-benzeri enzim 3 Ang I dönüştürülür astroglial 10 sentezlenir, muhtemelen prorenin prorenin reseptörüne bağlanan11, ve daha sonra, bol beyindeki 12 nöronların hücre dışı yüzeyi üzerinde eksprese edilir anjiyotensin dönüştürücü enzim ile Ang II ile dönüştürüldü. Ang II oluşturulan bu intrabrain 1 beyin ve kan yoluyla bulaşan Ang II izole edilmiştir 2 reseptörlerinde agonistidir.
AT 1 R, önemli bir fizyolojik rol oynarken, daha iyi öncelikle kalp-damar sistemi ve böbrekler (Şekil 2) etkileyen, vücutta, patofizyoloji etkileri bilinmektedir. Ang II AT 1 R bağlandığında, bu vazokonstriksiyona neden olur; kan akışına direnci arttırarak ve kan basıncını yükselterek. Ayrıca, artan sodyum ve su retansiyonu giden, aldosteron ve vazopresinin sentez ve salgılanmasını teşvik eder. Bu etkiler, iskemik beyin tahribatı ve bilişsel bozuklukları uyarabilir ve Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ile bağlantılı olduğu ve diabetes, son zamanlarda tespit ediliyor yanı sıra, öğrenme ve hafıza 13-15 etkileyecek. Böbrekte jukstaglomerüler hücreler üzerinde 1 R AT ki RAS bir geribesleme döngüsü renin salgısı yoktur inhibe olduğunu. İlginçtir, AT 2 R genellikle 1 R AT, diğerleri 16-20 arasında vazodilatasyon, nörit büyümesini, aksonal rejenerasyon, anti-çoğalmasını ve cerebroprotection neden eylemi karşı düzenler. AT 2R, aynı zamanda, anti-hipertansiyon ve en son, anti-kanser ilaçları 21 için bir hedef olarak tanımlanmıştır. çeşitli dokularda içinde Ang II reseptörlerinin lokalizasyonu ve yoğunluğunu belirleme ve nasıl RAS belirli hastalıklarda oynadığı rolü ortaya çıkarmak yarayacak nicel dansitometrik reseptör otoradyografisim kullanarak çeşitli tedaviler ve hastalık durumlarında tarafından etkilenmektedir.
Reseptör otoradyografi anjiyotensin I varlığını göstermek için etkili bir yöntem olarak 30 yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadırI reseptörleri beyinde RAS diğer bileşenleri ve deneysel koşullara 22-34 çeşitli altında sıçan, fare, kobay, köpek ve insan ve diğer dokular. Beyin içinde Ang II reseptörlerini bulma önemi bir beyinde Ang II eylemleri fonksiyonel nöroanatomisini uygulayabilirsiniz olduğunu, örneğin, hipotalamus (PVN) paraventriküler çekirdeğinde AT 1 R varlığı Ang bir fonksiyonu göstermektedir beyindeki II vasopresin, oksitosin veya kortikotropin salan hormon (CRH) serbest ya da sempatik sinir sisteminin aktivasyonu uyarmak için. Bu nedenle, en 1 R bloke eden ilaçlar, beyin RAS aktivitesi ile ilişkili bu PVN aracılı bazı etkileri azaltabilir. Work in progress 1 R antagonistleri AT kullanımı CRH Travma Sonrası Stres Bozukluğu (TSSB) bağlı salınımını azaltmak ve TSSB belirtileri iyileştirmek düşündürmektedir (Hurt ve ark., Yayımlanmak üzere gönderilen). PVn, subfornicalOrgan (SFO), ve amigdala homeostasis, iştah / susuzluk, uyku, hafıza, duygusal tepki düzenleyen bilinir ve bu gösteri çalışmanın hedef alanlardır. Bu bölgeler, mikroskop lamları üzerinde beyin koronal kesitler toplanması ve Ang II reseptörleri için spesifik radyo-ligand ile birlikte spesifik inhibitörleri olan bölümleri muamele edilmesiyle incelendi. Bu çalışmada, önerilen satıcılar ile birlikte tüm maddeleri ve reaktif maddeler listelenmiş iyot-125 daha sonra mono- 125 I olarak saflaştırılan bir Ang II reseptör antagonisti, sarkosin 1, izolösin 8 Ang II (SI Ang II), radyolabel kullanılmıştır edilir Daha önce tarif edildiği gibi 35, HPLC yöntemleri kullanılarak -Si Ang II. Bu yüksek bir spesifik aktivitesi radyo-ligand kullanımı X-ışını filmine radyo-etiketli bölümleri maruz kaldıktan sonra, düşük, orta ve yüksek reseptör yoğunluğu alanlarının görülmesine olanak verir. İyot-125, belirli bir miktarda bilinen miktarlarda içeren beyin macun standartlarına filmi kalibre tarafındanBir alanda bağlanmış Ang II reseptörünün belirlenebilir. Deneysel çalışmalarda, deneysel konularda beyinlerinde bağlanması Ang II reseptör kontrol grubunun beyinlerinde olduğu mukayese edilebilir. Bu Ang II eylemleri genetik durum, fenotipik anormallik, hastalık durumunun veya ilaç tedavisine yanıt değişmiş olup olmadığını gösterebilir. Bu bilgi daha sonra RAS düzensizliklerine bağlı hastalıkların tedavisi için terapiler geliştirilmesi için uygulanabilir. Düşük anatomik çözünürlükte ancak siteler reseptör bağlanma tespit Alternatif teknikler, ayrışma sabiti olarak radyoligand bağlanma afinitesini belirlemek için bir konsantrasyon aralığı üzerinde radyo-ligand ile kuluçkalanır doku homojenatlarında türetilen doku zar müstahzarları kullanan analizler (KD bağlayıcı Çevrede doku) ve maksimum bağlanma kapasitesi (B Max).
Burada açıklanan protokol 5 büyük işbirliği içine bölünebilirmponents: Reseptör Otoradyografi için Doku Bölümler hazırlanması; Reseptör Otoradyografi; Film Pozlama ve Gelişimi; Histoloji; VE DENSİTOMETRİK Görüntü Analizi.
Açıklanan protokol, bir kemirgen beyin önce hasat edilmiş ve -80 ° C'de saklandı koronal bölümlerin bitişik bölümlerinde Radyoligandın bağlanması, toplam "ve" non-spesifik "görselleştirme tanımlar ve hemen hemen her dokuya kolayca uygulanabilir olabilir anatomik reseptörlere veya radyoligand bağlanma sitelerinin diferansiyel miktarları görüntülemek altyapılarını çözmüştür. protokolü kapsamında açıklanan prosedürler basit ve analiz sonuçlarını doğru yorumlamak i?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH Grant HL-113905
500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
Photo flo | Kodak | 1464502 | |
Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
NaCl | Fisher | S271 | |
Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
Permount | Fisher | SP15-100 | |
PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
Thionin | Fisher | T409-25 | |
X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL |