Génération de signalisés et Mutants dans Modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
Les cyanobactéries sont un phylum ancienne et diverse évolutionnaire des bactéries présentes dans presque tous les milieux naturels sur la Terre. Dans les écosystèmes marins , ils sont particulièrement abondants et jouent un rôle clé dans de nombreux cycles de nutriments, ce qui représente environ la moitié de la fixation du carbone 1, la majorité de l' azote fixation 2 et des centaines de millions de tonnes de la production d'hydrocarbures 3 dans les océans chaque année. Chloroplastes, l'organite responsable de la photosynthèse dans les algues et les plantes eucaryotes, sont susceptibles d'avoir évolué à partir d' une cyanobactérie qui a été englouti par un organisme hôte 4. Les cyanobactéries se sont révélés utiles des organismes modèles pour l'étude de la photosynthèse, le transport d'électrons 5 et les voies biochimiques, dont la plupart sont conservés dans les plantes. En plus des cyanobactéries sont de plus en plus utilisé pour la production de denrées alimentaires, les biocarburants 6, 7 et électricité industriels composés 8, en raison de leur salutconversion ghly efficace de l' eau et du CO 2 à la biomasse en utilisant l' énergie solaire 9. De nombreuses espèces peuvent être cultivées sur des terres non arables avec des nutriments minimaux et l'eau de mer, ce qui suggère que les cyanobactéries pourraient être cultivées à grande échelle sans affecter la production agricole. Certaines espèces sont également des sources de produits naturels, y compris les antifongiques, antibactériennes et anti-cancer composés 10,11.
La capacité de générer des mutants est essentielle pour comprendre la photosynthèse des cyanobactéries, la biochimie et la physiologie, et essentielle pour le développement de souches à des fins industrielles. La majorité des études publiées générer des souches génétiquement modifiées par insertion d'une cassette de résistance aux antibiotiques au site d'intérêt. Cela limite le nombre de mutations qui peuvent être introduites dans une souche, car seulement quelques cassettes de résistance aux antibiotiques sont disponibles pour une utilisation dans les cyanobactéries. Les souches contenant les gènes conférant aux antibiotiques resistance ne peut pas être utilisé pour la production industrielle dans les étangs ouverts, ce qui est susceptible d'être le seul moyen rentable pour produire des biocarburants et autres produits à faible valeur 12. La génération de mutants non marqués surmonte ces limitations. les mutants non marqués ne contiennent pas d'ADN étranger, à moins d'inclure intentionnellement, et peuvent être manipulées à plusieurs reprises. Par conséquent, il est possible de générer autant de modifications dans une souche telle que souhaitée. En outre, des effets polaires sur les gènes en aval du site de modification peuvent être minimisés, ce qui permet une modification plus précise de l'organisme 13.
Pour générer des souches de mutants, des plasmides suicides contenant au moins deux fragments d'ADN identiques à des régions dans le chromosome de cyanobactéries flanquant le gène à supprimer (appelée 5 'et 3' des régions adjacentes) sont tout d'abord construit. Deux gènes sont ensuite insérés entre ces régions adjacentes. L'un d'entre eux codant pour une protéine de résistance à un antibiotique; le second code SacB, qui produces levansucrase, un composé conférant une sensibilité au sucrose. Dans la première étape du procédé, les mutants marqués, les souches contenant l' ADN étranger certains sont générés. Le produit de construction de plasmide est mélangé avec les cellules de cyanobactéries, et l'ADN est repris naturellement par l'organisme. Les transformants sont sélectionnés par croissance sur des plaques d'agar contenant l'antibiotique approprié et le génotype mutant vérifié par PCR. plasmides de suicide ne peuvent pas se répliquer dans la souche d'intérêt. Par conséquent, toutes les colonies résistantes aux antibiotiques vont résulter d'un événement de recombinaison dans lequel le gène d'intérêt inséré dans le chromosome. Pour générer des mutants non marqués, le mutant marqué est ensuite mélangé avec un second plasmide suicide ne contenant que les régions flanquantes 5 'et 3'. Cependant, si l'insertion de l'ADN étranger est nécessaire, un plasmide consistant en 5 'et 3' des régions avec une cassette contenant les gènes d'intérêt inséré entre ces fragments d'ADN flanquant, peut être utilisé. Selection est par croissance sur des plaques de gélose contenant du saccharose. Sous forme de saccharose est létal pour les cellules lorsque le produit du gène sacB est exprimé, les seules cellules qui survivent sont ceux dans lesquels un deuxième événement de recombinaison a eu lieu, de sorte que le gène de la sensibilité du saccharose, en plus du gène de résistance aux antibiotiques, a été recombinée de la le chromosome et sur le plasmide. En conséquence de l'échange par recombinaison, les régions de flanquement et des ADN entre eux sont insérés dans le chromosome.
Nous avons utilisé avec succès ces méthodes pour générer de multiples mutations chromosomiques dans la même souche de Synechocystis sp. PCC6803 (ci – après dénommé Synechocystis) 13,14, pour introduire des mutations ponctuelles dans un gène d'intérêt et 13 pour l' expression de cassettes de gènes. Alors que la génération de KO non marqués a été démontrée avant notre travail dans Synechocystis 15,16, une méthode détaillée, aidé parune présentation visuelle des étapes critiques, ne sont pas accessibles au public. Nous avons également appliqué la même méthode pour la production de KO marquées dans un autre modèle cyanobactérie, Synechococcus sp. PCC7002 (ci – après dénommé Synechococcus). Ce protocole offre une méthode claire et simple pour générer des mutants et un protocole rapide pour la validation et le stockage de ces souches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques dans la production de mutants non marquées sont: 1) la conception plasmidique soin d'assurer que la région ciblée est modifiée; 2) veiller à ce que les échantillons restent axénique, en particulier lorsqu'elles sont cultivées sur le saccharose; 3) le placage des cellules pour la production mutante marquée sur BG11 transformé d'abord des plaques de gélose dépourvues d'antibiotiques, suivie par l'addition d'agar-agar, plus des antibiotiques 24 heures plus …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à l'Environmental Services Association Education Trust, la biologie synthétique dans le fonds Synbio Cambridge et le Ministère de la justice sociale et l'autonomisation, Gouvernement de l'Inde, pour un soutien financier.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
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