הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
כחוליות מהוות מערכה עתיקה ומגוונת אבולוציונית של חיידקים נמצאים כמעט בכל סביבה טבעית על פני כדור הארץ. בשנת מערכות אקולוגיות ימיות הם במיוחד שופע לשחק תפקיד מפתח במחזורים מזין רבים, והיוו כמחצית קיבוע פחמן 1, רוב קיבוע חנקן 2 ומאות מיליוני טונות של ייצור פחמימנים 3 באוקיינוסים בשנה. כלורופלסטים, אברון האחראי על הפוטוסינתזה אצות איקריוטיים וצמחים, צפויים התפתחו מתוך cyanobacterium כי נבלע על ידי הפונדקאי 4. כחוליות הוכיחו אורגניזמים מודל שימושי לחקר הפוטוסינתזה, אלקטרון התחבורה 5 ו הביוכימיים, שרבים מהם שמורים בצמחים. בשנת כחוליות בנוסף יותר ויותר בשימוש לייצור מזון, דלק ביולוגי 6, חשמל 7 ותעשייתיים תרכובות 8, בשל היי שלהםהמרה יעילה ghly מים ו- CO 2 עד ביומסה באמצעות אנרגיה סולארית 9. מינים רבים יכולים להיות מעובד על קרקע שאינה חקלאית עם חומרים מזינים מינימאליים ומי ים, דבר המצביע על כך כחוליות עלולים להיות מבוגרים בקנה מידה גדולה מבלי להשפיע ייצור חקלאי. מינים מסוימים הם גם מקורות של מוצרים טבעיים, כולל תרכובות נגד פטריות, אנטיבקטריאלי ואנטי סרטן 10,11.
היכולת ליצור מוטציות היא מפתח להבנת פוטוסינתזה כחוליות, ביוכימיה ופיזיולוגיה, וחיוני להתפתחות של זנים למטרות תעשייתיות. רוב המחקרים שפורסמו גנרטור מהונדס גנטי זנים ידי החדרת קלטת עמידות לאנטיביוטיקה לתוך האתר של עניין. זה מגביל את מספר מוטציות יכולות להיות מוחדר זן, כמו שרק כמה קלטות עמידות לאנטיביוטיקה זמינות לשימוש כחוליות. זנים המכילים גנים המקנות מחדש אנטיביוטיsistance לא יכול לשמש לייצור תעשייתי בבריכות פתוחות, אשר צפוי להיות אמצעי היחיד החסכוני לייצר דלק ביולוגי ומוצרים בעלי ערך נמוך אחרים 12. הדור של מוטציות לא מסומנות מתגבר על מגבלות אלה. מוטציות לא מסומנות אינם מכילים דנ"א זר, אלא אם כן נכלל בכוונה, וניתן לטפל מספר פעמים. לכן אפשר ליצור שינויים רבים ב זן כפי רצויות. בנוסף, תופעות קוטב על גנים במורד הזרם של אתר שינוי ניתן למזער, המאפשר שינוי מדויק יותר של האורגניזם 13.
כדי ליצור זנים מוטנטים, פלסמידים התאבדות המכיל שני קטעי דנ"א זהה אזורים בכרומוזום כחוליות איגוף הגן למחיקה (שמכונה 5 'ו 3' אזורי איגוף) בנויים ראשון. שני גנים ואז מוכנס בין אזורי איגוף אלה. אחד מהם מקודד חלבון עמידות לאנטיביוטיקה; השני מקודד SacB, אשר לדרבןuces levansucrase, תרכובת מקנה רגישה סוכרוז. בשלב הראשון של התהליך, מוטציות מסומנות, זנים כלומר המכילים כמה דנ"א זר, נוצרות. הבונה פלסמיד הוא מעורבב עם התאים כחוליות והדנ"א נלקח באופן טבעי על ידי האורגניזם. Transformants נבחר על ידי צמיחה על צלחות אגרו המכילות את אנטיביוטי המתאים ואת הגנוטיפ המוטציה מאומת על ידי PCR. פלסמידים התאבדות לא יכולים לשכפל בתוך הזן של עניין. לכן כל מושבות עמידות לאנטיביוטיקה תגרומנה מאירוע רקומבינציה לפיה הגן של עניין מוכנס לתוך הכרומוזום. כדי ליצור מוטציות לא מסומנות, המוטציה הניכרת הוא מעורב אז עם פלסמיד התאבדות נוסף שהכיל רק 5 'ו 3' אזורי האיגוף. עם זאת, אם החדרת דנ"א זר נדרשה, פלסמיד המורכב של 5 'ו 3' איגוף אזורים עם קסטה המכילה את הגנים של העניין המוכנס בין קטעי דנ"א אלה, ניתן להשתמש. Sele גודלction היא באמצעות צמיחה על צלחות אגר המכיל סוכרוז. כמו סוכרוז הוא קטלני לתאים כאשר מוצר גן sacB מתבטא, התאים היחידים ששורדים הם אלה שבם אירוע רקומבינציה שני התרחש, לפיה גן רגישות סוכרוז, בנוסף גן העמידות לאנטיביוטיקה, כבר recombined מתוך כרומוזום על פלסמיד. כתוצאה מכך של חילופי recombinational, אזורי האיגוף וכל DNA ביניהם מוכנסים לתוך כרומוזום.
השתמשנו בהצלחה בשיטות אלה כדי ליצור מוטציות כרומוזומליות מרובות באותו הזן של Synechocystis sp. PCC6803 (להלן המכונה Synechocystis) 13,14, להציג מוטציות נקודה אחת לתוך גן של עניין 13 ו לביטוי של קלטות גן. בעוד הדור של knockouts המסומנת הודגם לפני עבודתנו Synechocystis 15,16, שיטה מפורטת, שנעזרמצגת ויזואלית של השלבים הקריטיים, הוא לא זמין לציבור. גם יש לנו ליישם אותה השיטה לייצור של knockouts ניכרה cyanobacterium מודל אחר, sp Synechococcus. PCC7002 (להלן המכונה Synechococcus). פרוטוקול זה מספק שיטה ברורה, פשוטה ליצירת מוטציות ובפרוטוקול מהיר על תיקוף ואחסון זנים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בדור של מוטציות לא מסומנות הם: 1) עיצוב פלסמיד זהיר כדי להבטיח את אזור המיקוד רק משתנה; 2) להבטיח כי דגימות להישאר axenic, במיוחד כאשר בתרבית על סוכרוז; 3) ציפוי טרנספורמציה תאים עבור דור מוטציה מסומן בתחילה על צלחות אגרו BG11 חסרי אנטיביוטיקה, ואחריו תו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים טראסט לחינוך סביבתי שירותים האגודה, ביולוגיה סינתטית בקרן קיימברידג SynBio ומשרד צדק חברתי והעצמה, ממשלת הודו, עבור תמיכה כספית.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
References
- Zwirglmaier, K., et al. Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes. Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).
- Galloway, J. N., et al. Nitrogen cycles: past, present, and future. Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).
- Lea-Smith, D. J., et al. Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).
- Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. The origin of plastids. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).
- Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- McCormick, A. J., et al. Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system. Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).
- Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems. Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).
- Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. Engineering cyanobacteria to generate high-value products. Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).
- Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).
- Tan, L. T. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery. Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).
- Volk, R. B., Furkert, F. H. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth. Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).
- Scott, S. A., et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity. Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).
- Lea-Smith, D. J., et al. Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities. Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).
- Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).
- Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 – Consequences for pigment biosynthesis and accumulation. J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).
- Castenholz, R. W. Culturing methods for Cyanobacteria. Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).
- Mitschke, J., et al. An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).
- Ried, J. L., Collmer, A. An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis. Gene. 57, 239-246 (1987).
- Vieira, J., Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19, 259-268 (1982).
- Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).
- Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).
- Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002. J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).
- Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803. Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).
- Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).
- Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol. , (2015).
