Генерация маркированы и безмаркерных Мутанты в модельных видов цианобактерий
Summary
Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.
Abstract
Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of ‘escape’ of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.
Introduction
Цианобактерии являются эволюционно древней и разнообразной филюм бактерий, обнаруженных в почти каждой природной среды на Земле. В морских экосистемах они особенно обильны и играют ключевую роль во многих питательных циклов, что составляет примерно половину фиксации углерода 1, большинство фиксации азота 2 и сотни миллионов тонн добычи углеводородов 3 в океане ежегодно. Хлоропласты, органелл отвечает за фотосинтез в эукариотических водорослей и растений, вероятно, произошли от цианобактерии , которая была охвачена организма – хозяина 4. Цианобактерии доказали полезные модели организмов , предназначенных для изучения фотосинтеза, транспорта электронов 5 и биохимических путей, многие из которых сохраняется в растениях. Для этого цианобактерий все чаще используются для производства пищевых продуктов, различных видов биотоплива 6, электричество 7 и промышленных соединений 8, из – за их приветльное эффективное преобразование воды и CO 2 на биомассу с использованием солнечной энергии 9. Многие виды могут быть выращены на не пахотной земли с минимальными питательными веществами и морскую воду, предполагая, что цианобактерии потенциально можно выращивать в больших масштабах, не затрагивая сельскохозяйственного производства. Некоторые виды также являются источниками натуральных продуктов, в том числе противогрибковыми, антибактериальными и противоопухолевыми соединениями 10,11.
Способность генерировать мутантов является ключом к пониманию цианобактерий фотосинтез, биохимии и физиологии, а также важное значение для развития штаммов для промышленных целей. Большинство опубликованных исследований генерируют генетически модифицированные штаммы путем введения антибиотика кассеты сопротивления в месте интереса. Это ограничивает число мутаций, которые могут быть введены в штамм, а всего лишь несколько антибиотических кассет сопротивления доступны для использования в цианобактерии. Штаммы, содержащие гены, придающие повторно антибиотиктивление не может быть использован для промышленного производства в открытых водоемах, который, вероятно, будет единственным экономически эффективным средством для производства биотоплива и других продуктов с низким значение 12. Поколение немаркированных мутантов преодолевает эти ограничения. Немаркированные мутанты не содержат чужеродной ДНК, если намеренно не включены, и ими можно манипулировать несколько раз. Поэтому можно создавать столько изменений в штамме по своему желанию. Кроме того, полярные эффекты на гены ниже сайта модификации , может быть сведено к минимуму, что позволяет более точно модификации организма 13.
Для создания мутантных штаммов, самоубийство плазмид, содержащих два фрагмента ДНК идентичны областям в цианобактерий хромосомы, фланкирующих ген должен быть удален (называется 5 'и 3' фланкирующие области) сначала построены. Два гена, которые затем вставляются между этими фланкирующих. Один из них кодирует антибиотик белок устойчивости; вторая кодирует SACB, который Продлевансахаразу спам, соединение придания чувствительности к сахарозе. На первом этапе процесса, отмечены мутанты, т.е. штаммы , содержащие некоторую чужеродную ДНК, образуются. Плазмидной конструкции смешивают с цианобактерий клеток и ДНК ресуспендировали естественным организмом. Трансформанты отбирали по росту на чашках, содержащих соответствующий антибиотик, и мутантный генотип проверены с помощью ПЦР. Суицид плазмид не может реплицировать в пределах требуемого штамма. Поэтому любые резистентные к антибиотикам колоний будет результатом рекомбинации в результате чего ген, представляющий интерес в вставленную в хромосому. Для генерации немаркированных мутантов, отмеченный мутант затем смешивают со вторым самоубийцы плазмидой, содержащий только 5 'и 3' фланкирующие области. Тем не менее, если введение чужеродной ДНК требуется, плазмиду, состоящую из 5 'и 3' фланкирующие области с кассетой, содержащей гены, представляющие интерес, вставленной между этими фрагментами ДНК, могут быть использованы. Селефикция это с помощью роста на чашках с агаром, содержащей сахарозу. Поскольку сахароза является летальной для клеток , когда продукт гена SACB выражается, только клетки , которые выживают , являются те , в которых произошло второе событие рекомбинации, в результате чего ген сахарозы чувствительность, в дополнение к гену устойчивости к антибиотику, был рекомбинируют из ряда хромосомы и на плазмиды. Как следствие рекомбинацнонного обмена, фланкирующие области и любую ДНК между ними вставлены в хромосому.
Мы успешно использовали эти методы , чтобы генерировать множественные мутации в хромосомных того же штамма Synechocystis зр. PCC6803 (далее именуемые как Synechocystis) 13,14, ввести единые точечные мутации в ген интереса 13 и для экспрессии гена кассет. В то время как поколение немаркированных нокаутов было продемонстрировано до нашей работы в Synechocystis 15,16, подробный метод, которому помогаетвизуальное представление важных шагов, не является общедоступной. Кроме того, мы применили тот же метод для генерации отмеченными нокаутов в другой модели цианобактерии, Synechococcus зр. PCC7002 (далее именуемой Synechococcus). Этот протокол обеспечивает четкий, простой способ для генерации мутантов и быстрый протокол для проверки и хранения этих штаммов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги в формировании немаркированных мутантов являются: 1) тщательная разработка плазмида для обеспечения только изменен целевой области; 2) обеспечение того, чтобы образцы остаются аксенический, особенно при культивировании на сахароза; 3) металлизация трансформирован…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Environmental Services Association Education Trust, синтетической биологии в Кембриджском СинБио фонда и министерства социальной справедливости и расширения прав и возможностей, правительство Индии, за финансовую поддержку.
Materials
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 mL conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 mL round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
References
- Zwirglmaier, K., et al. Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes. Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).
- Galloway, J. N., et al. Nitrogen cycles: past, present, and future. Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).
- Lea-Smith, D. J., et al. Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).
- Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. The origin of plastids. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).
- Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- McCormick, A. J., et al. Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system. Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).
- Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems. Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).
- Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. Engineering cyanobacteria to generate high-value products. Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).
- Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).
- Tan, L. T. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery. Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).
- Volk, R. B., Furkert, F. H. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth. Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).
- Scott, S. A., et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity. Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).
- Lea-Smith, D. J., et al. Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities. Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).
- Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).
- Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 – Consequences for pigment biosynthesis and accumulation. J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).
- Castenholz, R. W. Culturing methods for Cyanobacteria. Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).
- Mitschke, J., et al. An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).
- Ried, J. L., Collmer, A. An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis. Gene. 57, 239-246 (1987).
- Vieira, J., Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19, 259-268 (1982).
- Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).
- Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).
- Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002. J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).
- Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803. Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).
- Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).
- Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol. , (2015).
