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Biology

Mucin agarose जेल वैद्युतकणसंचलन: उच्च आणविक वजन Glycoproteins के लिए पश्चिमी सोख्ता

Published: June 14, 2016 doi: 10.3791/54153
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Marsico Lung Institute/CF Center, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

Abstract

Mucins, भारी-ग्लाइकोसिलेटेड श्लैष्मिक सतहों अस्तर प्रोटीन, हमलावर रोगजनकों के खिलाफ उपकला की रक्षा के द्वारा सहज रक्षा की एक प्रमुख घटक के रूप में विकसित किया है। इन अणुओं की मुख्य भूमिका है जबकि म्यूकोसा के स्नेहन को बढ़ावा देने के कण फँसाने और निकासी की सुविधा के लिए है। प्रोटीन संश्लेषण के दौरान, mucins तीव्र हे ग्लाइकोसिलेशन और multimerization, जो नाटकीय रूप से बड़े पैमाने पर और इन अणुओं के आकार में वृद्धि से गुजरना। ये बाद translational संशोधनों बलगम के viscoelastic गुणों के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन अणुओं की जटिल जैव रासायनिक और biophysical प्रकृति का एक परिणाम के रूप में, mucins के साथ काम करने में कई चुनौतियों है कि पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण के तरीकों से दूर नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अपने उच्च आणविक वजन नियमित रूप से polyacrylamide जैल के माध्यम से electrophoretic प्रवास को रोकता है और उनके चिपचिपा प्रकृति प्रयोगात्मक ट्यूबिंग के लिए आसंजन कारण बनता है। हालांकि, स्वास्थ्य में mucins की भूमिका की जांच(जैसे।, श्लैष्मिक अखंडता को बनाए रखने) और रोग (जैसे।, Hyperconcentration, mucostasis, कैंसर) ने हाल ही फायदा हुआ है और ब्याज mucins एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में जांच की जा रही है। उत्पादन और mucin अणुओं के समारोह के एक बेहतर समझ उपन्यास दवा दृष्टिकोण, जैसे, mucin दाना exocytosis और / या mucolytic एजेंटों के अवरोधकों को जन्म दे सकता है। इसलिए, सुसंगत और विश्वसनीय प्रोटोकॉल जांच करने के लिए जीव विज्ञान mucin वैज्ञानिक उन्नति के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहाँ, हम पारंपरिक विधियों का वर्णन एक agarose जेल का उपयोग वैद्युतकणसंचलन द्वारा mucin अणुओं को अलग, nitrocellulose झिल्ली में प्रोटीन हस्तांतरण, और mucin विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ संकेत के रूप में अच्छी तरह से अवरक्त फ्लोरोसेंट जेल पाठक पता लगाने के लिए। इन तकनीकों में mucin quantitation, multimerization निर्धारित करने के लिए और mucins पर औषधीय यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं।

Introduction

Mucins सामान्य रूप से श्लैष्मिक सतहों कि बाहरी वातावरण के संपर्क में गुहाओं लाइन द्वारा उत्पादित कर रहे हैं (जैसे।, श्वसन, पाचन, प्रजनन इलाकों, नेत्र सतह) के साथ ही आंतरिक अंगों (जैसे, अग्न्याशय, पित्ताशय की थैली, स्तन ग्रंथियों)। इन ग्लाइकोप्रोटीन की उपस्थिति सतह हाइड्रेशन का कहना है और रोगजनकों के खिलाफ एक शारीरिक बाधा रूपों। हालांकि mucin उत्पादन, स्वास्थ्य mucosal को mucin hyperconcentration और / या न्यायपालिका बलगम गुण वाहिनी बाधा, बैक्टीरियल उपनिवेशवाद और जीर्ण सूजन है, जो अपरिवर्तनीय ऊतकों को नुकसान का कारण बन सकते हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं आवश्यक है। घटनाओं की एक समान झरना, कई बीमारियों में मनाया जाता है जैसे।, सिस्टिक फाइब्रोसिस 1, पुरानी ओटिटिस मीडिया 2 और cervicovaginal संक्रमण 3। इसलिए, यह स्वास्थ्य और रोग में mucins की भूमिका को समझने के लिए और प्रोटीन की पहचान के लिए नियमित प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

तारीख तक19 mucins जीन 22,000 (जैसे, MUC16) अमीनो एसिड के लिए पहचान की गई है और बड़े पॉलीपेप्टाइड 1,200 से लेकर श्रृंखला के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना (जैसे।, MUC1)। mucin जीन परिवार के दो उप-प्रकारों में बांटा जा सकता है: झिल्ली जुड़े mucins, सेल संकेतन और सतह के परिरक्षण में शामिल है, और जेल के गठन mucins, बलगम जैल के viscoelastic गुणों के लिए जिम्मेदार है। झिल्ली जुड़े mucins ज्यादातर monomeric कर रहे हैं और एक हाइड्रोफोबिक झिल्ली फैले डोमेन के माध्यम से सेल सतहों को देते हैं। इसके विपरीत, जेल के गठन mucins कई वॉन Willebrand कारक (vWF) की तरह और सिस्टीन अमीर डोमेन है कि गतिशील बहुलक नेटवर्क के गठन के लिए आवश्यक हैं के पास है। बड़े ग्लाइकान सेरीन और threonine अवशेषों apomucin भर में वितरित से जुड़े होते हैं। ये घने हे लिंक्ड oligosaccharides आणविक वजन 4 से 80% करने के लिए योगदान कर सकते हैं। अंतर और अंतर-आणविक डाइसल्फ़ाइड mucin monomers को जोड़ने बांड mucin जेल networ की अखंडता को सुनिश्चितकश्मीर। भारी ग्लाइकोसिलेशन और multimerization का एक परिणाम के रूप में, mucins जानवरों की दुनिया में सबसे बड़ा अणुओं के बीच में हैं और पारंपरिक एसडीएस पृष्ठ polyacrylamide जेल और मानक प्रोटीन सीढ़ी का उपयोग कर मानक जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। इन विधियों 250 केडीए की तुलना में कम आणविक वजन के साथ / अलग प्रोटीन को हल करते हुए mucin monomers MUC16 के मामले में 2 एमडीए तक पहुंच सकता है। हालांकि, उच्च आणविक वजन प्रोटीन सीढ़ी छोटे mucin monomers अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी।, MUC1)।

तकनीक की एक किस्म mucin आकार, रचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। परंपरागत रूप से, mucins के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन, denaturing बफर में isopycnic घनत्व-ढाल centrifugation के माध्यम से अलगाव mucin द्वारा पूरा किया है आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी और immunodetection के द्वारा पीछा (जैसे।, स्लॉट सोख्ता) 5। गतिशील और / या बहु कोण प्रकाश बिखरने mucin युक्त नमूनों की oligomeric राज्य के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं <sup> 1। इसके अलावा, दर-जोनल centrifugation immunodetection और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर सामान्यतः mucins 6 की macromolecular रचना निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री भी mucins यों प्रोटिओलिटिक दरार का पता लगाने और oligosaccharide रचना 1,7,8 का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तरह की तकनीक महंगी हैं, समय लेने वाली और अक्सर बड़ी मात्रा में और / या नमूना के उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। कार्यप्रणाली, यहाँ बताया अर्थात्।, वैद्युतकणसंचलन द्वारा जुदाई mucin, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, कम लागत और उच्च throughput अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता रिश्तेदार mucin quantitation प्रदान करते हैं और बहुलक विधानसभा की खोजबीन की। हालांकि, इस परख उच्च आत्मीयता, उच्च विशिष्टता mucin एंटीबॉडी कि दुर्लभ mucins के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए।, MUC19) या कुछ प्रजातियों (जैसे।, सुअर, भाल)।

Agarose पश्चिमी सोख्ता concentra साथ mucin युक्त नमूनों की एक विस्तृत विविधता को हल करने के लिए उपयुक्त है50 माइक्रोग्राम / (जैसे।, बलगम) 5 मिलीग्राम / एमएल (जैसे।, सेल washes) मिलीलीटर से लेकर माहौल। इस परख 1990 के दशक में शुरू किया गया था और केवल कुछ विशेष प्रयोगशालाओं 9,10 में प्रदर्शन किया गया था। प्रारंभ में, इस तकनीक मानव श्वसन स्राव 11,12 में mucin monomers के उप-जनसंख्या की पहचान में मदद की और जाम कोशिकाओं में oligomerization प्रक्रिया, Golgi उपकरण 13 में डिमर multimerization द्वारा पीछा किया जालिका में डिमर गठन के होते हैं जो की पुष्टि की। हाल ही में, murine mucins के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी के छोटे पशु मॉडल पर अध्ययन (जैसे।, कमी, βENaC, ओवीए चुनौती दी माउस मॉडल mucin) की और से बलगम को दूर करने के उद्देश्य से परीक्षण औषधीय यौगिकों preclinical अध्ययन के लिए अनुसंधान के एक नए क्षेत्र में खोला फेफड़ों 14-17। जीव विज्ञान और उपन्यास की पीढ़ी mucin में एक बढ़ती रुचि का एक परिणाम के रूप में, और अधिक विशिष्ट mucin एंटीबॉडी, हम herei का वर्णनn कार्यप्रणाली agarose जेल वैद्युतकणसंचलन, nitrocellulose और दो रंग अवरक्त फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए वैक्यूम हस्तांतरण द्वारा mucins अलग करने के लिए।

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Protocol

1. mucin जेल पश्चिमी सोख्ता के लिए तैयार बफ़र

  1. 50x TAE (Tris-एसीटेट EDTA) बफर के 1 लीटर तैयार करें।
    1. आसुत जल (DH 2 हे) के 700 एमएल में Tris आधार (0.4 मीटर) के 242 जी, हिमनदों एसिटिक एसिड के 57.1 ग्राम (तौलना तरल) (0.2 एम) और ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (50 मिमी) की 14.61 ग्राम जोड़ें।
    2. 8.0 पीएच को समायोजित करें और मात्रा DH 2 ओ के साथ 1 लीटर तक बना
  2. 10x लोड हो रहा है बफर के 10 मिलीलीटर की तैयारी।
    1. 1x TAE बफर के 5 मिलीलीटर की तैयारी। ऐसा करने के लिए, ग्लिसरॉल (50%) के 5 मिलीलीटर, bromophenol नीला (0.25%) के 25 मिलीग्राम, और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) (1%) के 100 मिलीग्राम जोड़ें।
  3. 20x सोडियम साइट्रेट खारा (एसएससी) बफर के 2 लीटर तैयार करें।
    1. DH 2 हे की 1.5 लीटर में, सोडियम क्लोराइड (3 एम) के 350.6 जी और trisodium साइट्रेट (ना 3 सी 6 एच 5 हे 7) (0.3 एम) का 176.4 ग्राम जोड़ें। 7.0 पीएच को समायोजित करें और DH 2 ओ के साथ 2 लीटर मात्रा को बनाने के
  4. 1x ताए-0.1% एसडीएस बफर के 1 लीटर तैयार करें।
    1. DH 2 ओ की 980 मिलीलीटर के लिए 50x TAE के 20 मिलीलीटर जोड़ें एसडीएस की 1 ग्राम एक 0.1% एसडीएस TAE समाधान बनाने के लिए जोड़ें।

2. ताए-एसडीएस agarose जेल तैयारी

  1. (। यानी, 150 मिलीलीटर) - 7 मिमी मोटी जेल पर्याप्त मात्रा डालो एक माइक्रोवेव Erlenmeyer फ्लास्क में 1x ताए-0.1% एसडीएस बफर के एक 5 बनाने के लिए। 0.8% (1.2 जी) agarose पाउडर जोड़ें।
  2. (- 3 मिनट आमतौर पर 1) agarose जब तक रुक-रुक कर घूमता साथ 30 सेकंड के अंतराल में माइक्रोवेव कुप्पी पूरी तरह से भंग कर रहा है। इस प्रक्रिया के दौरान गर्म हाथ पैड का प्रयोग करें। ज्वालामुखी उबलते से सावधान रहो, जबकि घूमता।
  3. 10 मिनट - agarose समाधान 5 के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें। नोट: agarose समाधान डाला जा करने के लिए तैयार हो जाएगा, जब कुप्पी के नीचे 5 सेकंड के लिए हथेली पर छोड़ा जा सकता है।
  4. टेप के साथ किनारों सील और अच्छी तरह से रखने की स्थिति में कंघी द्वारा वैद्युतकणसंचलन ट्रे कास्टिंग (10 x 15 सेमी) तैयार करें।
  5. टी में धीरे-धीरे agarose समाधान डालोवह ट्रे कास्टिंग बुलबुले के गठन से बचने के लिए। एक विंदुक टिप का उपयोग बुलबुले निकालें। जेल शांत करने के लिए और पूरी तरह से जमना के लिए प्रतीक्षा करें। एक बार जम, कंघी धीरे-धीरे हटाने सक्शन द्वारा कुओं ढहने से बचने और ट्रे के किनारों से टेप हटाने के लिए।
  6. agarose जेल जेल बॉक्स में रखें और 1x ताए-0.1% एसडीएस बफर के साथ वैद्युतकणसंचलन इकाई को भरने जब तक जेल पूरी तरह से कवर किया जाता है।

3. नमूना लोड हो रहा है और वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण

नोट: हमारी प्रयोगशाला में, हम आमतौर पर ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना तरल पदार्थ सहित दोनों माउस और मनुष्यों से नमूने, उपयोग, मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (HBe), और मानव लार और थूक के नमूनों से सेल धोने, (BALF दोनों प्रजातियों)। नमूने संग्रह पर 6 एम यूरिया में विकृत या proteinase कॉकटेल अवरोध जोड़कर समय (6 घंटा) का संक्षिप्त अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है।

  1. (प्रत्येक नमूने के लिए लोडिंग डाई का 10% जोड़कर अर्थात्। लोड करने के लिए नमूने तैयार, नमूना और 3 के 30 μlडाई की μl)। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूने homogenize। संक्षेप में बूंदों को इकट्ठा करने के लिए 5000 rpm पर ट्यूबों नीचे स्पिन।
  2. ध्यान से कुओं में नमूनों की बराबर मात्रा लोड।
    1. पूर्व गीला सुझाव और / या अत्यधिक चिपचिपा नमूनों की लोडिंग की सुविधा के लिए सकारात्मक विस्थापन pipettes का उपयोग करें। धीरे-धीरे महाप्राण 80 - नमूना-डाई समाधान के 90% (यानी, 27 - 30 μl) pipetting बुलबुले से बचने के लिए।
    2. धीरे-धीरे कुओं के तल पर लोड और उत्तरोत्तर ऊपर की ओर pipet टिप चलते हैं। नमूने है कि विंदुक टिप से जुड़े रहने के लिए, एक 45 डिग्री के कोण पर बांटना और सीधे अच्छी तरह से ऊपर बढ़ाना या धीरे रेशेदार बलगम तोड़ने के लिए अच्छी तरह से पक्ष का उपयोग करें। कुओं अधिभार मत करो।
  3. वैद्युतकणसंचलन बिजली जनरेटर के लिए जेल में बॉक्स के एक इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड ठीक से जुड़े हुए हैं (अर्थात्।, लाल नेतृत्व जनरेटर की सकारात्मक उत्पादन में खामियों को दूर) नकारात्मक अनुमति देने के लिए सकारात्मक दिशा में चलाने के लिए mucins का आरोप लगाया इलेक्ट्रोड।
  4. एक डबल कंघी जेल दो पंक्तियों के बीच ओवरलैप को रोकने के लिए 75 मिनट - एक कंघी जेल के लिए 90 मिनट, या 60 के लिए 80 वोल्ट पर जेल चला।
  5. जनरेटर बिजली बंद हो और शक्ति के स्रोत से इलेक्ट्रोड काट।
  6. ध्यान से यह सुनिश्चित करने के लिए जेल जगह में रहता ट्रे कास्टिंग के दोनों तरफ एक हाथ से जेल बॉक्स से जेल को हटा दें।

4. कुशल mucin स्थानांतरण के लिए agarose जेल में कमी

  1. ध्यान से एक ग्लास कंटेनर में जेल फ्लैट जगह है। DH 2 हे के साथ जेल कुल्ला ताए-एसडीएस बफर के निशान को दूर करने के लिए।
  2. DH 2 ओ की 800 मिलीलीटर में 20x एसएससी की 200 मिलीलीटर जोड़कर 4x एसएससी बफर के 1 लीटर तैयार 4x एसएससी बफर के 200 मिलीलीटर में ताजा डीटीटी की 309 मिलीग्राम जोड़कर 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) 4x एसएससी समाधान के 200 मिलीलीटर बनाओ।
  3. डीटीटी-4X एसएससी बफर और कवर के साथ जेल लेना। धीरे 20 मिनट (प्रति मिनट 10 घुमाव) के लिए रॉक। डीटीटी मुक्त 4x एसएससी बफर के साथ जेल कुल्ला।
"> 5। एक nitrocellulose झिल्ली वैक्यूम स्याहीचट विधानसभा और नमूना हस्तांतरण

  1. हस्तांतरण के लिए वैक्यूम चूसक तैयार करें।
    1. ध्यान से जेल (अर्थात्।, 10 x 15 सेमी) की तुलना में थोड़ा व्यापक आयामों पर nitrocellulose झिल्ली काटा।
    2. DH 2 हे के साथ गीले झरझरा चटाई और यह जगह चूसक में चिकनी-पक्ष-अप।
    3. डीटीटी मुक्त 4x एसएससी बफर के साथ गीले nitrocellulose झिल्ली और झरझरा चटाई के केंद्र में जगह है।
    4. कवर रबर गैसकेट के साथ झरझरा चटाई, गैस्केट ठीक nitrocellulose झिल्ली के साथ गठबंधन के उद्घाटन छोड़ने। अगर झरझरा चटाई अभी भी दिखाई दे रहा है, ध्यान से कोई अंतर नहीं गैस्केट और झिल्ली के बीच बनी हुई है सुनिश्चित करने के लिए झिल्ली को समायोजित।
  2. ध्यान से झिल्ली के शीर्ष पर agarose जेल जगह है। जेल रूपों सुनिश्चित करें एक तंग और जेल के कुओं गैसकेट के साथ सील हस्तांतरण के लिए झिल्ली पर तैनात हैं।
    1. झिल्ली और जेल के बीच बुलबुले के गठन से बचें। कम करने के लिएबुलबुले के गठन, धार 4x एसएससी की कुछ बूँदें झिल्ली पर बफर और ऊपर से नीचे तक जेल स्लाइड किसी भी गठन बुलबुले फ्लश करने के लिए। झिल्ली पर जेल चलती से बचने के रूप में प्रोटीन तुरंत दाग शुरू हो जाएगा।
  3. ध्यान से 4x एसएससी बफर के साथ जेल कवर।
  4. सक्शन द्वारा mucin हस्तांतरण शुरू करो।
    1. 50 मिलीबार - 40 पर वैक्यूम चूसक पर और दबाव सेट कर दें। बाहर सुखाने से जेल को रोकने के लिए 10 मिनट - हर 5 जेल पर 4x एसएससी बफर की कुछ बूँदें जोड़ें। 90 मिनट के लिए चलाने के लिए स्थानांतरण। वैकल्पिक: पूरा होने पर, उन्मुखीकरण के लिए एक पेंसिल के साथ कुओं के निशान।
  5. जेल के निपटान और झिल्ली के किनारे पर प्लास्टिक चिमटी का उपयोग कर nitrocellulose झिल्ली निकालते हैं।

6. झिल्ली रोकने और जांच

  1. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ तुरंत झिल्ली कुल्ला। झिल्ली बाहर सूखी मत देना।
  2. एक प्रबंधक की भूमिका पर बफर और जगह अवरुद्ध 3% दूध-पीबीएस के 50 मिलीलीटर में विसर्जित कर दिया झिल्ली1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर cker। ऊष्मायन के बाद, अवरुद्ध बफर त्यागें।
  3. 1% दूध-पीबीएस प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में झिल्ली विसर्जित कर दिया। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में झिल्ली सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें। बफर अवरुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी समाधान के 2,000 अनुपात: एक करने के लिए 1 प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। नोट: चूहों से होने वाले नमूनों के लिए, हम यूएनसी 222 खरगोश विरोधी Muc5b और बकरी विरोधी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उपयोग करें। इंसानों से होने वाले नमूनों के लिए, हम H300 विरोधी MUC5B और 45M1 विरोधी MUC5AC प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  4. धो झिल्ली 3 एक घुमाव पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ बार।
  5. 1% दूध-पीबीएस माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में झिल्ली विसर्जित कर दिया। (। उदाहरण के लिए, 700 विरोधी खरगोश और 680 विरोधी बकरी) बफर अवरुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी समाधान के 7,500 अनुपात और एक घुमाव पर 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते एक 1: करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी पतला। एक गैर-पारदर्शी सह में incubating द्वारा प्रकाश से बचानेntainer। 1 घंटे के बाद माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें।
  6. धो झिल्ली 3 से 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ बार। DH 2 हे के साथ झिल्ली कुल्ला नमक निकालने के लिए।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अवरक्त प्रतिदीप्ति सिस्टम पर झिल्ली पढ़ें।

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Representative Results

हम चूहों के फेफड़ों (चित्रा 1) से BALF में agarose जेल वैद्युतकणसंचलन निम्नलिखित mucin अभिव्यक्ति का प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। इस उदाहरण में, हम टीजी-Muc5ac माउस मॉडल का आईएल -13 इलाज के बाद उत्पादन mucin की अपरेगुलेशन दिखाने के लिए agarose जेल का इस्तेमाल किया। पश्चिमी धब्बा mucin अभिव्यक्ति है, जो multimer या मोनोमर बैंड संकेत तीव्रता (चित्रा 2) का एक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक दृश्य प्रतिनिधित्व दिखाता है। इस विधि को भी मानव ब्रोन्कियल उपकला (HBe) सेल धोने और मानव थूक के नमूनों में mucins की अभिव्यक्ति को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि के एजेंटों को कम करने के साथ इलाज के बाद mucins की कमी दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम डीटीटी (चित्रा 3) की सांद्रता में वृद्धि के साथ इलाज किया HBE धोने से प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं। हम multimer संकेत तीव्रता के नुकसान को कम करने के लिए एक उम्र के साथ उपचार के साथ mucin कमी निम्न मात्रा निर्धारितNT (चित्रा 4)।

आकृति 1
चित्रा 1. mucin उत्पादन की upregulation टीजी-Muc5ac / ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का आईएल -13 उपचार (GFP) के माउस मॉडल के बाद overexpressing Muc5ac GFP के साथ टैग चूहे पीबीएस के साथ डाले गए थे। (-) या आईएल -13 (+) के लिए प्रेरित करने जाम सेल इतरविकास और फेफड़ों (एन = समूह प्रति 3) में वृद्धि mucin उत्पादन। BALF काटा और mucin agarose पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से अलग हो गए थे। झिल्ली एक खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी Muc5b (लाल) और एक बकरी पॉलीक्लोनल विरोधी GFP (हरा) के साथ जांच की गई थी। अवरक्त प्रणाली आच्छादन के रूप में परिणाम दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या काले और सफेद करने के लिए छवियों को बदलने के लिए विकल्प के साथ एक चैनल के रूप में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2. mucin agarose जेल आईएल 13 इलाज चूहों में mucin स्राव के अपरेगुलेशन दिखा के मात्रात्मक विश्लेषण। Muc5b संकेत तीव्रता चित्र 1 में दिखाया mucin जेल के प्रत्येक लेन के लिए मापा गया था। परिणाम बताते हैं कि mucin स्राव बढ़ गया था भर में 5.1 गुना आईएल 13 पशुओं का इलाज में पीबीएस इलाज चूहों (एन = 3, पी <0.005)। के रूप में दिखाया गया डेटा ± SEM मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. डीटीटी। HBE washes के साथ इलाज किया HBE Washes में MUC5AC और MUC5B mucins की कमी 30 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 और 100 मिमी डीटीटी के साथ इलाज किया गया minutतों। झिल्ली एक खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी MUC5B (हरा) और एक माउस पॉलीक्लोनल विरोधी MUC5AC (लाल) के साथ जांच की गई थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. डीटीटी। MUC5AC और MUC5B संकेत तीव्रता के साथ व्यवहार HBE Washes में multimeric बैंड की mucin agarose जेल दिखा लापता होने की मात्रात्मक विश्लेषण mucin जेल के प्रत्येक लेन के लिए मापा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पश्चिमी सोख्ता इस वीडियो में वर्णित mucin के प्रोटोकॉल आणविक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है और अलग तरह के डीएनए के रूप में बड़े अणुओं, हस्तांतरण करने के लिए, प्रोटीन का पता लगाने के लिए नियमित रूप से तकनीक, अर्थात्।, Immunoblotting के साथ पारंपरिक तकनीकों को जोड़ती है। उसी तकनीक का इस तरह के उच्च आणविक भार hyaluronic एसिड 18 के टूटने के रूप में जटिल ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकन्स, के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस तकनीक assays के एक विस्तृत रेंज में इस्तेमाल किया जा सकता है, सफल agarose पश्चिमी सोख्ता कदम है कि जटिल और समय पर निर्भर कार्यों की आवश्यकता होती है की एक भीड़ पर निर्भर करता है। आदेश सफलता को अधिकतम करने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम समीक्षा की जानी चाहिए।

नमूना तैयार करने और जेल लोड हो रहा सटीक परिणाम के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। Mucin युक्त नमूने, अर्थात्।, Sputa, कर रहे हैं, प्रकृति, प्रयोगात्मक ट्यूबिंग के अनुयायी, अर्थात्।, Pipet सुझावों, अपकेंद्रित्र ट्यूब, फिल्टर द्वारा। सकारात्मक विस्थापन pipets और पूर्व के उपयोग केpipet सुझावों -wetting कुओं में viscoelastic सामग्री की लोडिंग की सुविधा कर सकते हैं। इस तरह के नमूने बढ़ उछाल और इन सामग्रियों की चिपचिपाहट के कारण विशेष रूप से ध्यान देने की आवश्यकता होती है। केंद्रित नमूने (5 मिग्रा से ऊपर / एमएल) खराब एक 0.8% agarose जेल के छेद के आकार के माध्यम से विस्थापित होगा और आगे कमजोर पड़ने और / या अप करने के लिए 6 एम यूरिया में विकृतीकरण आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, guanidinium रूप guanidinium क्लोराइड (GuHCl) में विकृत नमूने चल एसडीएस के साथ वेग होगा बचें। इसलिए, GuHCl में संग्रहीत नमूनों एक अतिरिक्त डायलिसिस कदम की आवश्यकता है। गैर-बहुलक स्थिति के अध्ययन के लिए, आंशिक कमी (5 मिनट के लिए 0.5 मिमी डीटीटी) बहुत केंद्रित नमूने (चित्रा 3 देखें) के पलायन में सुधार होगा।

nitrocellulose झिल्ली के लिए प्रोटीन हस्तांतरण इस प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है और, अगर परिशुद्धता के साथ निष्पादित नहीं, दाग झिल्ली, कमजोर संकेत और झूठे मात्रात्मक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। नाजुक और आसानी से दूषित nitrocellulose झिल्ली कर रहे हैं औरहमेशा दस्ताने के साथ संभाला और unspecific बाध्यकारी और नुकसान से बचने के लिए परवाह किया जाना चाहिए। झिल्ली पर जेल की नियुक्ति एक तंग सील पैदा करते हैं और स्थानांतरण बफर रिसाव, जो दाग में परिणाम और स्थानांतरण क्षमता कम होगी रोकने के लिए सटीक संरेखण की आवश्यकता है। जेल और झिल्ली के बीच बुलबुले के गठन प्रोटीन हस्तांतरण को रोकने जाएगा और ध्यान से बचा जाना चाहिए।

इष्टतम immunodetection उच्च आत्मीयता, उच्च विशिष्टता लक्ष्य mucin की प्रोटीन रीढ़ की हड्डी के खिलाफ एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। हाल ही में, उपन्यास टीकाकरण रणनीति, प्रतिजन डिजाइन और स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकियों mucin एंटीबॉडी की पीढ़ी के साथ वृद्धि हुई है सफलता के लिए उपज और mucin जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए नए उपकरण उपलब्ध कराए। आदेश में एक धब्बा, अर्थात्।, MUC5AC और MUC5B पर दो अलग अलग mucins का पता लगाने के लिए, दो प्राथमिक एंटीबॉडी अलग मेजबान प्रजातियों, यानी, खरगोश और बकरी से प्राप्त किया जा चाहिए। इसके अलावा, माध्यमिक एंटीबॉडी अलग fluorophore के साथ लेबल करने की आवश्यकतादोनों 700 nm- और 800 एनएम चैनल में पता लगाया जा सके।

सापेक्ष mucin बहुतायत और mucin आकार इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ सीधे quantitated जा सकता है। फ्लोरोसेंट संकेत नमूने का एक व्यापक रेंज की मात्रा का ठहराव, कम (जैसे।, सेल washes) उच्च करने से (जैसे।, बलगम) mucin एकाग्रता की अनुमति के सीधे लक्ष्य mucin की राशि के लिए आनुपातिक है। हालांकि, पूर्ण mucin एकाग्रता mucin मानकों, जो इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया गया था की शुद्धि की आवश्यकता के रूप में यह एक लंबी और कठिन प्रक्रिया है कि अब्दुल्ला एट अल। 19 में वर्णित किया गया है। इसके अलावा, agarose पश्चिमी सोख्ता polymerization या depolymerization की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए mucin पारी assays प्रदर्शन करने की संभावना प्रदान करता है। Mucins के electrophoretic गतिशीलता उनकी बहुलक राज्य, यानी पर निर्भर करता है।, बड़े पॉलिमर के पलायन देरी हो रही है, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एजेंटों को कम करने के लिए एक गतिशीलता श प्रेरित करेगासंकेत है कि बलगम की biophysical गुणों में परिवर्तन के साथ संबद्ध के IFT। इस तरह परख mucin multimerization प्रक्रिया 13 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन यह भी mucin नेटवर्क 11 को प्रभावित करने के उद्देश्य से औषधीय एजेंटों परीक्षण करने के लिए। समाप्त करने के लिए, agarose पश्चिमी सोख्ता प्रतिदीप्ति लेबलिंग के साथ मिलकर mucin काफी उच्च गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा का निर्माण करके mucins अध्ययन करने के लिए हमारे दृष्टिकोण बदल गया है।

कम संकेत तीव्रता, उच्च पृष्ठभूमि और / या झिल्ली पर punctates की उपस्थिति: agarose पश्चिमी सोख्ता mucin निम्नलिखित परिणामों में परिणाम कर सकते हैं के साथ आम समस्याओं। कई समस्या निवारण रणनीतियों mucin जेल छवियों में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संकेत तीव्रता बड़ा नमूना मात्रा में लोड हो रहा है और / या प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी सांद्रता बढ़ाने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है। आमतौर पर, उच्च पृष्ठभूमि संकेत अपर्याप्त अवरुद्ध और / या धोने, जो लंबे समय तक ब्लॉक के प्रदर्शन से सुलझाया जा सकता है के कारण है/ Incubations धोने, साथ ही buffers कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं अवरुद्ध अनुकूलित का उपयोग कर। punctates की उपस्थिति में कमरे के तापमान है, जो बैक्टीरिया विकास की सुविधा पर बढ़ाया झिल्ली incubations का नतीजा हो सकता है। Punctates भी डीटीटी भिगोने समाधान से nitrocellulose झिल्ली क्षति (4.1 कदम) के कारण हो सकता है और अच्छी तरह से हस्तांतरण से पहले agarose जेल rinsing और / या 5 मिमी डीटीटी एकाग्रता कम से बचा जा सकता है।

agarose पश्चिमी सोख्ता mucin की मुख्य सीमा उच्च आणविक वजन प्रोटीन और mucin मानकों के लिए प्रोटीन की सीढ़ी है, जो पूर्ण mucin मात्रा का ठहराव hinders की कमी है। mucin agarose जैल से प्रकाशित परिणामों में से अधिकांश आकार और एकाग्रता के लिए तुलनात्मक अध्ययन कर रहे हैं। अपवर्तनांक के साथ मिलकर प्रकाश बिखरने के साथ आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी एक और तकनीक आमतौर पर सटीक आणविक वजन और बड़े अणुओं की एकाग्रता का निर्धारण किया जाता है। हालांकि, इस तकनीक महंगा एक हैएन डी mucins के लिए विशिष्टता का अभाव है, इसलिए, उपायों के अन्य बड़े अणुओं के नमूने, जैसे, डीएनए में शामिल थे। इसके अलावा, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी mucin प्रकार के बीच अंतर करने के लिए, असमर्थ है अर्थात्।, MUC5AC बनाम MUC5B, और उपायों और औसत एकाग्रता और mucins के मिश्रण से आकार दिए गए नमूने में शामिल थे।

अन्य तकनीकों गतिशील और बहु कोण प्रकाश 1, isopycnic और दर-जोनल centrifugations 6 बिखरने, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,7,8 सहित mucins अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, उपन्यास औषधीय mucin अणुओं को निशाना एजेंटों की जांच के साथ, यह जरूरी mucin जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय प्रयोगशाला तकनीकों का विकास होता है। Agarose पश्चिमी सोख्ता mucin एक अपेक्षाकृत आसान है और सस्ती तकनीक है कि, अर्थात्। Mucin प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बोझ, आकार और अनुपात mucin में बदल जाते हैं। इस परख इस्तेमाल किया जाएगाभविष्य अनुप्रयोगों में इन विट्रो में और इन विवो मॉडल में पक्षपाती बलगम दूर करने के उद्देश्य उपन्यास अणुओं के लिए दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता परीक्षण करने के लिए।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई विवाद नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Base Sigma T6060-1kg 1 kg
Glacial Acetic Acid Sigma ARK2183-1L 1 L
EDTA Sigma EDS-100g 100 g
Glycerol Fisher BP229-1 1 L
Bromophenol Blue Sigma 114391-5g 5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Sigma L6026-50g 50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer Promega V4261 1 L
NaCl Fisher S271-1 1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) Sigma W302600-1kg 1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)  Sigma D0632 25 g
Milk Powder Saco Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Gibco lifetechnologies 14200-025 500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) Rockland antibodies and assays 600-101-215 1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) Santa Cruz sc-20119 200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) Abcam ab3649 100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye LI-COR Biosciences 926-32213 0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye LI-COR Biosciences 926-68022 0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray Owl Seperation Systems
Power Supply Box Biorad Model 200/20
Membrane Blotting Paper Amersham  10600016 
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane  GE  10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v Expotech USA 230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System LI-COR Biosciences

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References

  1. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  2. Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
  3. Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
  4. Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
  5. Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
  6. Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
  7. Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
  8. van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
  9. Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
  10. Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
  11. Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
  12. Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
  13. Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
  14. Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
  15. Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
  16. Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
  17. Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
  18. Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
  19. Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 112 mucins उच्च आणविक वजन ग्लाइकोप्रोटीन एसडीएस agarose जेल वैद्युतकणसंचलन वैक्यूम चूसक nitrocellulose झिल्ली डबल धुंधला प्रतिदीप्ति
Mucin agarose जेल वैद्युतकणसंचलन: उच्च आणविक वजन Glycoproteins के लिए पश्चिमी सोख्ता
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Ramsey, K. A., Rushton, Z. L., Ehre, … More

Ramsey, K. A., Rushton, Z. L., Ehre, C. Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins. J. Vis. Exp. (112), e54153, doi:10.3791/54153 (2016).

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