Abstract
Mukinler, mukoza yüzeyleri astar ağır glikozile proteinler, işgalci patojenlere karşı epitel koruyarak doğal savunma önemli bir bileşeni olarak gelişmiştir. Bu makromoleküllerin ana rolü mukozasının yağlama teşvik ederken parçacık yakalama ve temizliğini kolaylaştıracak etmektir. Protein sentezi sırasında, müsinler dramatik bu moleküllerin kütle ve boyutunu artırmak yoğun O-glikosilasyon ve multimerizasyonunu, tabi. Bu post-translasyonel modifikasyonlar, mukus viskoelastik özellikleri için çok önemlidir. Bu moleküllerin karmaşık biyokimyasal ve biyofiziksel doğasının bir sonucu olarak, Müsinlerin ile çalışan geleneksel protein analiz yöntemleri ile üstesinden gelinemez birçok zorluklarla sağlar. Örneğin, yüksek molekül ağırlıklı düzenli poliakrilamid jeller vasıtasıyla elektroforetik göç engeller ve bunların yapışkan doğa deneysel boru yapışmayı neden olur. Ancak, sağlıkta Müsinlerin rolünü araştıran(Örn., Mukozal bütünlüğünü korumak) ve hastalık (örn., Hyperconcentration, mucostasis, kanser) son zamanlarda kazanmıştır faiz ve müsinler terapötik hedef olarak araştırılmaktadır. Üretim ve müsin makro moleküllerin işlevi daha iyi anlaşılması, yeni farmasötik yaklaşımlar, örneğin, musin granül Ekzositoz ve / veya mukolitik ajanlar önleyicileri neden olabilir. Bu nedenle, tutarlı ve güvenilir protokoller müsin biyoloji bilimsel ilerleme için kritik öneme sahiptir araştırmak. Burada, bir agaroz jelde elektroforez ile müsin makromolekülleri ayrı nitroselüloz zar içine protein transferi ve müsin özgü antikorlarla sinyali hem de kızıl ötesi floresan jeli okuyucu tespit etmek için bilinen yöntemler açıklanmaktadır. Bu teknikler müsin kantitatif, multimerizasyonunu belirlemek ve Müsinlerin farmakolojik bileşiklerin etkilerini test etmek yaygın uygulanabilir.
Introduction
Mukinlerin normalde dış ortama maruz kalan boşlukları hat mukoza yüzeyleri tarafından üretilen (örn., Solunum, sindirim, üreme yolları, oküler yüzey) yanı sıra iç organları (örneğin, pankreas, safra kesesi, meme bezleri). Bu glikoproteinlerin varlığı yüzey hidrasyon korur ve patojenlere karşı fiziksel bir bariyer oluşturur. musin üretimi geri dönüşümsüz doku hasarına neden olabilir kanal tıkanıklığının, bakteri kolonizasyonu ve kronik inflamasyon, yol açabilir, müsin hyperconcentration ve / veya anormal mukus özelliklerini sağlık mukozal için gerekli olmasına rağmen. Olayların benzer bir çağlayan, çeşitli hastalıklarda gözlenir örneğin., Kistik fibroz 1, kronik otitis media 2 ve servikovaginal enfeksiyon 3. Nedenle, sağlıkta ve hastalıkta Müsinlerin rolünü anlamak için ve protein belirlenmesi için rutin protokoller oluşturulması önemlidir.
Bugüne kadar19 müsinler genler tespit ve 1.200 arasında değişen geniş polipeptit zincirleri için kodlamak edilmiştir (örn., MUC1) 22000 (örneğin, MUC16) amino asitler için. musin gen ailesi, iki alt tipe ayrılabilir: mukus jellerin viskoelastik özellikleri için hücre sinyal ve yüzey koruyucu yer membrana bağlı müsinler, ve jel oluşturucu müsinler sorumludur. Zara bağlı müsinler çok monomer ve bir hidrofobik membran kapsayan alan aracılığıyla, hücre yüzeylerine ekleyin. Bunun tersine, jel-oluşturucu müsinler, dinamik polimerik ağların oluşumu için gerekli olan bir kaç von Willebrand faktörü (vWF) -benzeri ve sistein bakımından zengin alanlanna sahiptir. Geniş glikanları serin ve apomucin boyunca dağılmış treonin kalıntılarına eklenir. Bu yoğun O-bağlı oligosakaritler molekül ağırlığı 4% 80 kadar katkıda bulunabilir. müsin monomerleri bağlayan intra ve inter-moleküler disülfid bağları müsin jel networ bütünlüğünü sağlamakk. Ağır glikosilasyon ve multimerizasyon bir sonucu olarak, mukinler, hayvan dünyanın en büyük moleküller arasında ve geleneksel SDS-PAGE poliakrilamid jel ve standart protein merdiven kullanılarak standart jel elektroforezi ile analiz edilemez. müsin monomerler MUC16 durumunda 2 MDA kadar ulaşabilir ise bu yöntemler, 250 kDa daha düşük moleküler ağırlıkları / ayrı proteinler çözmek. Bununla birlikte, yüksek moleküler ağırlıklı bir protein merdivenleri küçük müsin monomerlerin incelemek için kullanılabilir (örneğin,., MUC1).
çeşitli teknikler müsin boyut, konformasyon ve etkileşimi incelemek için uygulanabilir. Geleneksel olarak, müsinlerin biyokimyasal karakterizasyonu boyut dışlama kromatografi ve İmmuno, ardından denatüre edici tampon maddesi içinde izopiknik yoğunluk gradyanlı santrifüj yoluyla izole musin ile gerçekleştirilir (örn.,, Yuva blot) 5. Dinamik ve / veya çok açılı bir ışık saçılım müsin zengin örneklerin oligomerik durumu ile ilgili bilgiler sağlayabilir <sup> 1. Buna ek olarak, immün ve transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte kuru bölgeli santrifüj yaygın müsinlerin 6 makromoleküler yapısını belirlemek için kullanılır. Kütle spektrometrisi, aynı zamanda, müsinleri ölçmek proteolitik bölünme algılamak ve oligosakarit bileşimin 1,7,8 analiz etmek için kullanılır. Bu teknikler zaman alıcıdır ve çoğu zaman büyük miktarlarda ve / veya örneğin, yüksek konsantrasyonlara ihtiyaç maliyetlidir. Yöntem, burada tarif edilen, yani., Elektroforez ile ayrılması, musin, yeniden üretilebilir ve düşük maliyetli olan ve göreli müsin kantitatif sağlar ve polimer grubunu araştırmak için yüksek verimli çalışmalarında kullanılabilir. Ancak, bu deney nadir Müsinlerin için mevcut olmayabilir yüksek afiniteli, yüksek özgüllük müsin antikorlar gerektirir (örn., MUC19) ya da bazı türlerin (örn., Domuz, gelincik).
Agaroz Western lekeleme konsantrasyonları ile müsin zengin örneklerin ve çeşitli çözmek için uygundur50 ug / ml (örn., hücre yıkama), 5 mg / ml (örneğin., balgam) arasında değişen leri. Bu tahlil 1990'larda tanıtıldı ve sadece birkaç özel laboratuvarlarda 9,10 gerçekleştirildi. Başlangıçta, bu teknik, insan solunum salgıları 11,12 müsin monomerlerin subpopülasyonunun belirlemek yardımcı oldu ve Golgi aygıtında 13 dimer multimerizasyon ardından endoplazmik retikulum dimer oluşumu oluşur goblet hücrelerinde oligomerizasyon işlemini doğruladı. Daha yakın zamanlarda, fare Müsinlerin karşı poliklonal antikorların üretimi mukus ortadan kaldırmayı hedefleyen test farmakolojik ajanlar küçük hayvan modellerinde çalışmalar (örn., Eksik, βENaC, OVA-meydan fare modelleri müsin) kolaylaştırdı ve preklinik çalışmalar için yeni bir araştırma alanı açtı akciğerler 14-17. biyoloji ve roman nesil müsin giderek artan ilgi sonucunda, daha spesifik müsin antikorlar, biz herei tarifN yöntemi, agaroz jel elektroforezi, nitroselüloz ve iki renkli kızıl ötesi floresan saptama vakum transferi ile müsinleri ayırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Musin Jel Western Blot için Tamponlar hazırlayın
- 50x TAE (Tris-asetat-EDTA) tampon maddesi içinde 1 litre hazırlayın.
- Damıtılmış su (DH 2 O) 700 ml Tris bazı (0.4 M) ve 242 g, buzlu asetik asit 57.1 g (ağırlık sıvı) (0.2 M) ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (50 mM) 14.61 g ekleyin.
- 8.0 pH ayarlayın ve dH 2 O ile 1 litre hacmi makyaj
- 10x yükleme tamponu 10 ml hazırlayın.
- 1x TAE tampon 5 ml hazırlayın. Bunu yapmak için, gliserol (% 50) 5 ml, bromofenol mavisi (% 0.25), 25 mg ve sodyum dodesil sülfat (SDS) (% 1), 100 mg ekleyin.
- 20x sodyum tuzlu sitrat (SSC) tampon 2 litre hazırlayın.
- DH 2 O 1,5 lt olarak, NaCl (3 M) 350.6 g ve trisodyum sitrat (Na 3 Cı 6H 5 O 7) (0.3 M) 176,4 g ekleyin. 7.0 pH ayarlayın ve dH 2 O. ile 2 litre hacim makyaj
- 1x TAE% 0.1 SDS tamponu 1 litre hazırlayın.
- DH 2 O 980 ml 50x TAE 20 ml ekleyin % 0.1 SDS-TAE solüsyon yapmak için SDS 1 gr.
2. TAE-SDS Agaroz Jel Hazırlanması
- (. Örneğin, 150 mi) - 7 mm kalınlığında jel yeterli hacmi dökün bir mikrodalga Erlenmeyer şişesi içinde 1x TAE% 0.1 SDS tamponu 5 yapmak için. % 0.8 (1.2 g) agaroz toz ekleyin.
- (- 3 dk genellikle 1) agaroz kadar aralıklı döndürme ile 30 saniye aralıklarla Mikrodalga balonu tamamen çözülür. Bu işlem sırasında sıcak el pedleri kullanmayın. dönen sırasında kaynama ile dikkatli olun.
- 10 dakika - agaroz çözüm için 5 soğumasını bekleyin. Not: şişenin alt 5 saniye boyunca avuç bırakılabilir zaman agaroz çözüm dökülecek hazır olacak.
- bantla kenarları sızdırmazlık ve konumda tarak iyi yerleştirerek elektroforez döküm tepsi (10 x 15 cm) hazırlayın.
- t yavaşça agaroz çözüm döküno kabarcıkların oluşumunu önlemek için tepsiyi döküm. Bir pipet kullanarak kabarcıklarını çıkarın. soğumaya tamamen katılaşması jel bekleyin. katılaşmış sonra emilerek kuyu çöken önlemek ve tepsinin kenarlarından bandı çıkarmak için yavaşça tarak kaldırmak.
- Jel kutunun içine agaroz jel yerleştirin ve jel tamamen kaplıdır kadar 1x TAE-% 0.1 SDS tamponu elektroforez birimini doldurun.
3. Numune Yükleme ve Elektroforez Ayırma
Not: Laboratuvarımızda, biz yaygın bronkoalveoler lavaj sıvısında da dahil olmak üzere fare ve insanlarda hem örnekleri, kullanmak, insan bronşiyal epitel hücreleri (HBE) ve insan tükürük ve balgam örneklerinden, hücre yıkama (BAL sıvısında iki tür). Numuneler tahsilatta 6 M üre içinde denatüre veya proteinaz kokteyl inhibitörü ekleyerek zaman (6 saat) kısa bir süre için saklanabilir.
- Örnek ve 3 (her bir örnek için yükleme boyası% 10 ilave edilerek, yani. Yüklemesi için numuneler hazırlayın, 30 ulBoyanın ul). Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından örnekleri homojenize. Kısaca damlacıkları toplamak için 5,000 rpm'de tüpler aşağı doğru döndürün.
- Dikkatle kuyulara numunelerin eşit miktarda yük.
- Ön ıslak uçları ve / veya yüksek viskoziteli bir numune yükleme kolaylaştırmak için pozitif yer değiştirme pipetler. Yavaşça aspire 80 - numune-boya solüsyonu% 90 (yani 27 - 30 ul) pipet kabarcıklarını önlemek için.
- Yavaş yavaş kuyu dibinde yüklemek ve giderek yukarıya doğru pipet ucu hareket ettirin. Pipet ucu bağlı kalır numuneler için, 45 ° açıyla dağıtmak ve düz kuyunun üstünde uzamış ya da hafifçe lifli mukus kırmak için kuyunun tarafını kullanın. kuyuları aşırı yükleme yapmayın.
- Elektroforez güç jeneratörüne jel kutusundan elektrotları bağlayın. Elektrotlar doğru bağlanıp bağlanmadığını emin olun (yani., Jeneratörün pozitif çıktı takılı kırmızı kurşun) olumsuz izin olumlu doğru çalıştırmak için müsinleri ücret elektrot.
- İki satır arasındaki örtüşme önlemek için bir çift tarak jel için 75 dakika - Tek bir tarak jel için 90 dakika ya da 60 80 Volt jel çalıştırın.
- Jeneratör güç kapatın ve güç kaynağından elektrotları ayırın.
- Dikkatle jel yerinde kalmasını sağlamak için döküm tepsinin her iki tarafında, bir yandan jel kutusundan jel çıkarın.
4. Verimli Musin Transferi Agaroz Jel azaltın
- Dikkatle cam kap içinde jel düz yerleştirin. TAE-SDS tamponu izlerini silmek için dH 2 O ile jel durulayın.
- DH 2 O 800 ml 20x SSC 200 ml ekleyerek 4x SSC tamponu 1 litre hazırlamak 4x SSC tamponu, 200 ml taze DTT 309 mg eklenerek 10 mM ditiyotreitol (DTT), 4x SSC çözeltisi 200 ml olun.
- DTT-4x SSC tamponu ve kapak ile jel ıslatın. Yavaşça 20 dakika (dakika başına 10 dönmeler) için sallayın. DTT içermeyen 4x SSC tamponu ile jel durulayın.
- transferi için vakum kurutma kağıdı hazırlayın.
- Dikkatle jel (yani., 10 x 15 cm) biraz daha geniş boyutlarda nitroselüloz membran kesti.
- DH 2 O ıslak gözenekli mat ve kurutma kağıdı pürüzsüz yan-up yerleştirin.
- DTT içermeyen 4x SSC tamponu ile ıslak nitroselüloz membran ve gözenekli mat merkezinde yerleştirin.
- tam nitroselüloz membran ile uyumlu conta açıklık bırakarak, lastik conta ile gözenekli mat örtün. gözenekli mat hala görünür ise, dikkatli boşluk conta ve membran arasında kalmasını sağlamak için membran ayarlayın.
- Dikkatli bir şekilde membran üzerine agaroz jeli yerleştirin. conta ile bir sıkı conta ve jelin kuyu transferi için zar üzerinde konumlandırılmış bir jel meydana getirir emin olun.
- membran ve jel arasındaki kabarcıklarının oluşumunu önlemek. en aza indirmek içinkabarcıklarının oluşumu, 4x SSC birkaç damla zar üzerinde tampon ve bir meydana kabarcıklar temizlemesini üstten alta jel slayt fışkırtma. proteinler hemen leke başlayacak şekilde zar üzerinde jel hareketli kaçının.
- Dikkatle 4x SSC tamponu ile jel kapsayacak.
- Emme ile musin transferi başlayın.
- 50 mBar'lık - 40 vakum AÇIK Kurutma kağıdını ve set basıncı çevirin. kurumasını jel önlemek için 10 dakika - jeli üzerinde her 5 4x SSC tamponu birkaç damla ekleyin. 90 dakika boyunca çalıştırın transferi. İsteğe bağlı: Tamamlandığında, yönlendirme için bir kalem ile kuyu işaretleyin.
- jel atınız ve membran kenarında plastik cımbız kullanarak nitroselüloz membran almak.
6. Membran Engelleme ve Algılama
- 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile hemen membran durulayın. Membran kurumasına izin vermeyin.
- Bir ro üzerinde tampon ve yeri engelleme% 3 süt-PBS 50 ml membran daldırın1 saat boyunca oda sıcaklığında cker. İnkübasyondan sonra, bloke tamponu atılır.
- % 1 süt PBS birincil antikor çözeltisi içinde membran bırakın. gece boyunca 4 ° C 'de bir rocker birincil antibodi çözeltisinin içine membran inkübe edin. İnkübasyondan sonra, birincil antikor solüsyonu atın. bloke edici tampon antikor çözeltisi 2.000: 1 oranında birincil antikorlar seyreltilir. Not: Farelerde gelen numuneler için, UNC 222 tavşan anti-Muc5b ve keçi anti-yeşil flöresanlı protein (GFP) kullanın. İnsanlarda gelen numuneler için, H300, anti-MUC5B ve 45M1 anti MUC5AC primer antikorlar kullanır.
- bir rocker 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın membran 3 kez.
- % 1 süt PBS ikincil antikor çözüm membran daldırın. (., Örneğin, 700, anti-tavşan ve anti-keçi 680) bloke edici tampon antikor çözeltisi 7.500 oranına ve bir rocker 1 saat oda sıcaklığında inkübe bir 1: ikincil antikorlar seyreltilir. şeffaf olmayan bir co inkübe edilerek ışıktan koruyunuzntainer. 1 saat sonra ikincil antikor çözüm atın.
- 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın membran 3 kez. Tuz kaldırmak için dH 2 O ile membran durulayın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir kızıl ötesi floresan sistemi membran okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu farelerin akciğerlerinde (Şekil 1) için BAL sıvısında, agaroz jel elektroforezi, aşağıdaki müsin temsili sonuçlarını gösterir. Bu örnekte, Tg-MUC5AC fare modelinde IL-13 tedavi, aşağıdaki mukin üretimini upregülasyonunu göstermek için agaroz jeli kullanılır. Western Blot mültimerden ya da monomer bant sinyal yoğunluğu (Şekil 2) bir kantitatif analiz için kullanılabilir müsin ifade, görsel temsilini gösterir. Bu yöntem, aynı zamanda, insan bronşiyal epitel (HBE) hücre yıkama ve insan balgam numunelerinde müsinlerin ifadesini göstermek için de kullanılabilir. Bu yöntem, indirgeme maddeleri ile muamele takip müsinlerin azalma göstermektedir için kullanılabilir. Bu DTT (Şekil 3) arasında artan konsantrasyonları ile muamele HBE yıkamanın Örnek sonuçlarını gösterir. Biz bir indirgeyici yaş tedavi ile musin azaltma aşağıdaki multimer sinyal yoğunluğu kaybı miktarınt (Şekil 4).
Tg-MUC5AC / Yeşil Floresan Protein IL-13 Tedavi (GFP) fare modeli takiben Şekil 1. yukarı regülasyonu Musin Üretim MUC5AC GFP ile etiketlenmiş fazla sentezleyen fareler PBS ile telkin edildi. (-) Veya IL-13 (+) ikna etmek için kadeh akciğer (grup başına n = 3) hücre metaplazisi ve müsin artış üretimi. BALF toplanır ve müsin agaroz Western blotting ile ayrılmıştır. Membran, bir tavşan poliklonal anti-Muc5b (kırmızı) ve bir keçi poliklonal anti-GFP (yeşil) ile problanmıştır. Kızılötesi sistem bir bindirme olarak sonuçlarını göstermek için kullanılan ya da siyah-beyaz görüntüleri değiştirmek için seçeneği ile tek bir kanal olarak. Edilebilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2, IL-13 ile tedavi edilmiş fareler mukinin salgısını yukarı doğru düzenleme Gösterilen Müsin agaroz jeli Kantitatif Analiz. Muc5b sinyal yoğunluğu, Şekil 1 'de gösterilen müsin jel her şerit için ölçülmüştür. Sonuçlar müsin sekresyonu artmış olduğunu göstermektedir 5,1 misli IL-13 ile tedavi edilen hayvanlarda PBS ile tedavi edilmiş farelerde (n = 3, p <0.005). Olarak gösterilen veriler ortalama ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
DTT. HBE yıkama ile tedavi HBE yıkamalarda MUC5AC ve MUC5B müsinlerin Şekil 3. İndirgeme 30 37 ° C'de 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 mM DTT ile muamele edildi minutes. Membran bir tavşan poliklonal anti-MUC5B (yeşil) ve bir fare poliklonal anti-MUC5AC (kırmızı) ile problanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
DTT. MUC5AC ve MUC5B sinyal yoğunluğu ile Tedavi HBE yıkar içinde Multimerik Band Musin Agaroz Jel Gösterilen Kaybolma Kantitatif Analiz müsin jel her kulvar için ölçüldü Şekil 4.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video açıklanan Batı blotting müsin protokol protein tespiti için düzenli teknikleri, yani., Immunoblotting ile, ayrı ve DNA gibi büyük makromoleküllerin, transfer moleküler biyolojide kullanılan geleneksel teknikler birleştirir. Aynı teknik, yüksek moleküler ağırlıklı hyalüronik aside 18 bozulması gibi karmaşık glikozaminoglikanlar biyolojisi çalışma uygulanabilir. Bu teknik deneylerin geniş bir aralıkta kullanılabileceğini, ancak başarılı bir agaroz Western lekeleme titiz ve zamana bağlı işlemleri gerektiren adımlar çok sayıda dayanır. başarıyı en üst düzeye çıkarmak amacıyla, bazı kritik adımlar gözden geçirilmelidir.
Örnek hazırlama ve jel yükleme doğru sonuçlar için kritik adımlar vardır. Müsin zengin örnekleri, yani., Balgamlari vardır, deneysel boru yapışık doğa, yani., Pipet ipuçları, santrifüj tüplerine, filtrelerle. pozitif deplasmanlı pipetleri ve ön kullanımıpipet uçları -wetting kuyulara viskoelâstik malzemenin yüklenmesini kolaylaştırır. Bu tür örnekler nedeniyle artan kaldırma kuvveti ve bu malzemelerin yapışkanlık özellikle dikkat gerektirir. Konsantre numuneleri (5 mg / ml'nin yukarısındaki) zayıf bir% 0.8 agaroz jeli gözenek boyutu ile göç edecek ve 6 M üre içinde daha fazla bir seyreltilmesini ve / veya denatürasyon gerektirebilir. Ancak, SDS ile çöker guanidinyum olarak guanidinyum klorür (GuHCl) 'de denatüre örnekleri çalışan kaçının. Bu nedenle, GuHCl saklanan örnekler ek diyaliz adımı gerektirir. Polimerik olmayan durum çalışmaları için, kısmi bir azalma (5 dakika boyunca 0.5 mM DTT) büyük ölçüde konsantre edilmiş numune (bakınız Şekil 3) geçişini artırır.
nitroselüloz zarına Protein transferi bu protokol için önemli bir adım olduğunu ve hassasiyet ile yürütülen değilse, lekeli zarının, zayıf sinyal ve yanlış kantitatif sonuçlara yol açabilir. Nitroselüloz membranlar hassas ve kolayca kontamineHer zaman eldiven ele ve belirsiz bağlayıcı ve zarar görmesini önlemek için dikkat edilmelidir. membran üzerine jel yerleştirilmesi sıkı bir mühür oluşturmak ve lekeleri neden ve transfer verimliliği azaltacak transferi tampon kaçağı önlemek için hassas hizalama gerektirir. , jel ve membran arasında kabarcık oluşumunu proteini aktarımını önlemek ve dikkatli bir şekilde kaçınılmalıdır.
Optimum immunodeteksiyon hedef müsin protein omurgasının karşı yüksek afiniteli, yüksek özgüllük antikorlar dayanmaktadır. Son zamanlarda, yeni aşılama stratejisi, antijen tasarımı ve tarama teknolojileri müsin antikor üretimi ile artan başarısı için verim ve müsin biyolojisi okumak için yeni araçlar sağladı. Bir leke örneğin., MUC5AC ve MUC5B iki farklı müsinleri tespit etmek için, iki primer antikorlar, farklı bir ev sahibi türünden, yani, tavşan ve keçi elde edilmelidir. Ayrıca, ikincil antikorlar farklı bir floroforla etiketlenmesi gerekirs hem 700 `/flj- ve 800 nm-kanal tespit edilecek.
Bağıl müsin bolluk ve müsin boyutu görüntüleme yazılımı ile doğrudan quantitated edilebilir. Flüoresan sinyal örnekleri, geniş bir aralık ölçümü, yüksekten (örn., Hücre yıkama), düşük (örn., Balgam) konsantrasyonu müsin sağlar, hedef müsin miktarı ile doğru orantılıdır. O Abdullah vd. 19'da açıklanan bir uzun ve zor bir süreçtir Ancak, mutlak müsin konsantrasyon bu protokolü açıklanan değildi müsin standartları, saflaştırılması gerektirir. Buna ek olarak, agaroz Western lekeleme polimerizasyon veya depolimerizasyon sürecini incelemek için musin vardiya deneyleri gerçekleştirme imkanı sağlar. Müsinlerin elektroforetik mobilite, büyük polimerlerin göç gecikir. Polimerik devlet, yani bağlıdır ve görüntüleme yazılımı kullanılarak belirlenebilir. Örneğin, indirgeyici ajanlar bir hareketlilik sh neden olacaktırmukus biyofiziksel özellikleri değişiklikler ile ilişkilidir sinyalin ift. Bu deney, musin multimerizasyon işlemi 13 çalışma için kullanılabilir, aynı zamanda musin ağı 11 etkilemeye yönelik farmakolojik maddelerin test edilmesi için. floresan etiketleme ile birleştiğinde agaroz Batı blotting müsin, sonuçlandırmak oldukça yüksek nitel ve nicel verilerin üreterek müsinleri incelemek için bizim yaklaşımını değiştirdi.
Düşük sinyal yoğunluğu, yüksek arka plan ve / veya zar üzerinde punctates görünümünü aşağıdaki sonuçlara yol olabilir Batılı blotting müsin agaroz ile ortak sorunlar. Birkaç sorun giderme stratejileri musin jel görüntüleri iyileştirmek için kullanılabilir. Sinyal yoğunluğu, daha büyük örnek hacimleri yükleme ve / veya birincil ve ikincil antikor konsantrasyonlarının arttırılmasıyla arttırılabilir. Tipik olarak, yüksek arka plan sinyali uzun blok yaparak çözülebilir yetersiz engelleme ve / veya yıkama, atfedilebilir/ Inkubasyon yıkama, hem de ticari olarak temin edilebilir bloke etme tamponları kullanılarak optimize edilmiştir. punctates görünümü bakteri üremesini kolaylaştırır, oda sıcaklığında genişletilmiş zar inkubasyon sonucu olabilir. Punctates da DTT ıslatma çözeltisinden nitroselüloz zar hasan (aşama 4.1) neden olabilir ve iyice aktarılmadan önce agaroz jeli durulama ve / veya 5 mM DTT konsantrasyonu azaldıkça önlenebilir.
Batı blotting musin agaroz ana sınırlama mutlak müsin miktarının engelleyen yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin ve müsin standartları protein merdiveni, eksikliğidir. müsin agaroz jelleri yayınlanan sonuçların çoğu boyutu ve konsantrasyon için karşılaştırmalı çalışmalar vardır. kırılma endeksi ile birlikte ışık dağılımı ile boyut çıkarma kromatografisi sık belirli bir moleküler ağırlığa ve makro moleküllerin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, bu teknik, pahalı a,ND müsin için özgül olmayabilir, dolayısıyla önlemler diğer büyük moleküller örnekleri, örneğin, DNA dahil edildi. Buna ek olarak, boyut dışlama kromatografisi, yani., MUC5AC karşı MUC5B, musin türleri arasında ayrım yapamaz ve tedbirler ve müsinlerin karışımından ortalama yoğunluğu ve büyüklüğü, belirli bir numune dahil edilmiştir.
Diğer teknikler 1, İzopiknik ve hızı bölgeli santrüfüj 6 saçılma dinamik ve çok açılı ışık, elektron mikroskobu, kütle spektrometresi 1,7,8 dahil müsinleri incelemek için kullanılabilir. Ancak, müsin molekülleri hedefleyen yeni farmakolojik ajanların soruşturma ile musin biyolojisi okumak için güvenilir laboratuvar teknikleri geliştirmek için zorunludur. Batı blotting musin Agaroz, yani. Müsin süreçleri ile ilgili önemli soruları cevaplamak için kullanılabilecek nispeten kolay ve ucuz bir tekniktir, yük, boyut ve oran müsin değişim. Bu deney, kullanılacakGelecekteki uygulamalarda in vitro ve in vivo modellerde yapışık mukus azaltma amaçlı yeni moleküllerin için ilaç etkinliği ve toksisitesini test etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir çatışma var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1 kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1 L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100 g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1 L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5 g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50 g |
| 20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1 L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1 kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25 g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 ml |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μg |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100 μg |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5 mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5 mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
References
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
