Introduction
Mätning av elektroretinogram (ERG) och visuellt framkallat potential (VEP) ger användbara kvantitativa bedömningar av integriteten av den visuella vägen. ERG mäter de elektriska svaren hos näthinnan för ljus stimulering, medan VEP mäter den motsvarande funktionella integriteten hos de visuella vägar från näthinnan till den primära syncentrum följa samma ljushändelse. Detta manuskript beskriver ett protokoll för registrering och analys av ERG och VEP svar på en vanligt förekommande laboratoriemodell, råttan.
ERG ger ett index på den funktionella integriteten hos ett antal nyckel retinala cellklasser genom att kvantifiera näthinnan brutto elektriska svar på en ljusblixt. En samordnad serie av joniska flöden initieras av ljus tillslag och hävning, producerar detekterbara förändringar i spänning som kan mätas med hjälp av ytelektroder placerade utanför ögat. Den resulterande vågformen representerar kombinationen av en serier av väldefinierade komponenter, som skiljer sig i amplitud, timing och frekvens. En avsevärd mängd forskning har visat att dessa komponenter är relativt väl bevarade över många ryggradsdjur retinae och att komponenterna kan separeras från varandra. Genom att omdömesgillt välja stimulus (flash stimulans, bakgrund, interstimulus intervall) villkor och välja särdragen i den sammansatta vågformen för att analysera en kan vara säker på att återvända ett mått på en specifik grupp av retinala celler 1,2. Dessa egenskaper ligger bakom verktyget och därmed den utbredda tillämpningar av ERG som en icke-invasiv mätning av näthinnan funktion. Detta manuskript fokuserar på metoder för att mäta ERG och analysera dess funktioner för att returnera information om några av de stora cellklasser i näthinnan, nämligen fotoreceptorer (PIII komponent), bipolära celler (PII komponent) och retinala ganglionceller (den positiva scotopic tröskel svar eller PSTR).
3. Hos gnagare majoriteten (90-95%) av optiska nervfibrer från varje öga decussate 4 och innerverar den kontralaterala mitten av hjärnan. Till skillnad från ERG, är det ännu inte möjligt att tillskriva olika komponenter i VEP till specifika cellklasser, 5 ändrar således någonstans längs den visuella vägen kan påverka VEP-vågformen. Icke desto mindre är VEP ett användbart icke-invasiv mätning av visuell prestanda och visuell väg integritet. VEP, när den används tillsammans med ERG, kan ge en mer fullständig bedömning av det visuella systemet (dvs näthinnan / visuella vägen).
ERG och VEP inspelningar kan utföras enskilt eller i kombination, beroende på tillämpkatjon. Den metod som beskrivs i detta dokument tillåter samtidig bedömning av retinal och kortikal visuellt framkallat elektro från båda ögonen och båda halvkloten i sövda råttor. Detta är ett bra sätt att mer omfattande bedömning retinal funktion och uppströms effekter som förändringar i näthinnans funktion kan ha på visuellt framkallat kortikala funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer utfördes enligt den australiska kodex för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål, som anges av National Health och Medical Research Council i Australien. Etik clearance erhölls från University of Melbourne, fakulteten, djuretikkommittén (godkännandenummer 0.911.322,1).
1. Preimplantatorisk av kronisk VEP elektroder
Obs: Om samtidiga ERG och VEP signaler skall samlas djur skall inopererade med VEP elektroder åtminstone en vecka före signal samling.
- Sterilisera kirurgiska bänken före experimentering genom att rengöra med klorhexidin (0,5% i 70% etanol). Autoklav all kirurgisk utrustning före användning. Täck djuret med en steriliserad kirurgisk duk. Se till att alla praktiker bär munskydd, skyddsrock och steriliserade handskar.
- Inducera anestesi med 3-3,5% isofluran med O2 vid en flödeshastighet av 3 I / min. upprätthålla anesthesia vid 1,5% och 2 L / min under hela operationen. Säkerställa tillräcklig anestesidjupet genom frånvaron av tass nypa reflex.
- Applicera ett% karboximetylcellulosa-natrium på hornhinnan för att förhindra uttorkning av ögonen.
- Raka en 30 mm x 30 mm område över pannan, bakre för ögonen och främre till öronen.
- Placera djuret på en värmedyna (37 C) för att upprätthålla kroppstemperaturen och stabilisera djurens huvud med en stereotaktisk ram.
- Desinficera det rakade området med 10% povidon-jod tre gånger. Undvik att använda alkoholbaserade antiseptiska medel för område nära ögat, är förenlig med Standard of Practice fastställts av Föreningen för kirurgiska Technologists.
- Gör en median-sagittal snitt på huvudet med en skalpell och från denna punkt en ~ 20 mm cirkel av dermalvävnad diameter att exponera skallbenet.
- Ta underliggande benhinnan genom skrapning och torkning med gasväv för att exponera koronala och sagittala kraniala suturer.
- Ossing en tand Burr fäst vid en borr, TREPANERA två hål (0,7 mm i diameter, djup ~ 1 mm) genom skallen på båda halvkloten på stereotaktiska koordinater: 7 mm kaudalt bregma, 3 mm i sidled till mittlinjen.
- Skruv i rostfria skruvar (diameter 0,7 mm, längd 3 mm, steriliserad med klorhexidin) i de två färdiga hål upp till ett djup av cirka 1 mm (2 mm skruven utsätts) för att tillåta fast förankring. Detta kommer i kontakt med dura utan att skada den underliggande kortikal vävnad.
- Förbered operationsområdet för dentalt amalgam genom torkning av skallbenet med gasbinda, och tillbakadragning lös hud med två 3-0 suturer vid ~ 4 och 08:00.
- Sprid amalgam över den exponerade skallen för att säkra skruvelektroderna (rostfria skruvar som beskrivs i steg 1,10) på plats. Se till ~ 1,5 mm skruvar förblir utsatt för inspelning.
- Ta bort indragnings suturer.
- Injicera 0,5% karprofen subkutant (5 mg / kg) för smärtlindring och saltlösning (natriumklorid 0,9%, en0,5 ml) subkutant för vätskeersättning.
- Låt djuret att återhämta sig i separata burar. Lämna inte djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
- Inte återvänder djuret till sällskap av andra djur förrän den har återhämtat sig helt från kirurgi (minst 5 dagar).
- Fortsätt att administrera 0,5% karprofen subkutant för analgesi (5 mg / kg) en gång per dag under 4 dagar.
- Spela ERG och VEP en vecka efter operationen.
2. ERG och VEP inspelning
- Datainsamling förberedelse
- Använd programvara för att samtidigt utlösa stimulans och hämta data 2 enligt inställningarna som rekommenderas nedan.
- Förstärka signaler 3 (ERG: × 1000, VEP: x10,000) med förstärkningen internt fastställts av en isolerad förförstärkare och förstärkare, och med båda ögonen matchade för impedans.
- Ställ samplingsfrekvens för ERG till 4 kHz över en 650ms inspelningsfönstret (2,560 poäng), För att göra detta, klicka på fliken för "tidbas" i datainsamlingsprogram (för namn och version av programvara Se tabell för material), välj "2560" för prov, och "500 ms" för tid som kommer att returnera en 650 msek inspelningsfönstret.
- Använd samma metod för att ställa in samplingsfrekvens för VEP till 10 kHz under en 250 ms epok. Låt en 10 msek före stimulans baslinjen för både ERG och VEP inspelningar. För att göra detta, klicka på "Inställningar" -fliken; välj "Stimulator" för att få upp ett nytt fönster dialog, i det fönstret väljer du "puls" från rullgardinsmenyn för "Mode"; och ställ in värdet för "fördröjning" till "10 ms".
- Set ERG bandpassfiltrering till 0,3 - 1000 Hz (- 3 dB). Detta görs genom att klicka på "Bio förstärkare" i datainsamling programvara. Ställ sedan in värdet för "High Pass" till "0,3 Hz", och värdet för "lågpass" till "1 kHz".
- Med hjälp av ovannämnda metod 2.1.1.3, ställa VEP bandpass inställningar till 0,1 - 100 Hz (- 3 dB) som rekommenderas av International Society for Clinical Elektro av Vision (ISCEV) för mänsklig VEP inspelningar 6.
- Använd programvara för att samtidigt utlösa stimulans och hämta data 2 enligt inställningarna som rekommenderas nedan.
- elektrod beredning
- Skräddarsyr de ERG aktiva / inaktiv och VEP aktiva / inaktiva elektroder genom att fästa silvertråd eller en krokodilklämma till en elektrodledning, respektive 2. Kommersiellt erhålla jordelektrod.
- För 4 skräddarsydda elektroder, skär den manliga änden från elektrodledningen förlängning. Ta bort 1 cm av yttre polytetrafluoretylen isolering beläggning med ett skalpellblad säkerställer den inre tråden inte är skadad.
- Pre-mode de ERG inaktiva elektroder genom att skära en 70 mm längd av silvertråd (0,3 mm tjocklek) och bildar en slinga ~ 8 mm i diameter för att omsluta råttans öga. Förbered en enhetlig cirkel genom att forma slingan på en 1 ml pipettspets.
- Pre-mode de ERG aktiva elektroder genom att skära en 30 mm längd av silvertråd och bildar en liten slinga för att försiktigt kontakta råtthornhinna (~ 1-2 mm i diameter)
- Säkert fästa elektroder (2 ERG aktiv, två ERG inaktiv, en VEP inaktiv) till elektroden ledning genom entwining silvret med den exponerade inre tråden.
- Isolera överskott exponerad metall med maskeringstejp för att minska solcells artefakter.
- På ERG inaktiva elektroder hålla en liten bit av krok-och-loop fästanordningen (~ 5 mm x 20 mm) till maskeringstejp för att göra det möjligt för stabil infästning till gnagare halsremmen.
- Fäst krokodilklämman till den inre tråden av elektroden leder till att VEP aktiva elektroder.
- Före inspelningar elektroplätera de exponerade ytorna av silvertrådar (dvs den inaktiva ring och aktive spets) med klorid med hjälp av en 9 V likströmskälla för 20 sekunder för att förbättra signalledning.
- För att göra detta, sänk den silverfärgade spetsen av ERG elektrodtråden (fungerar som anod av en primär cell) i normal saltlösning; anslut den andra änden av denna elektrodtråd till den positiva polen av en 9 V batteri.
- Anslut en annan tråd (katoden) till den negativa polen på batteriet och sänk den andra änden i saltlösning samt. Koppla efter 20 sekunder och observera flisa spetsen av ERG elektrodtråd som skall beläggas jämnt i vit färg.
Obs: Förbered nya ERG elektroder för varje experimentell session (~ upp till 8 timmar) för att säkerställa öppenhet av kloridbeläggningen.
- djur~~POS=TRUNC
- Dark-anpassa djuren över natten (≥ 8 h) före inspelning i en ljus tät rum. Säkerställa maximal mörkeranpassning genom att stänga av rummet ljus, stänga alla dörrar och persienner. Minimera ljusläckage genom att placera ljussäkra material runtkorsningar av dörrar / fönster och placering datorskärmar utanför tjocka svarta gardiner.
- Genomför djur beredning i ett mörkt rum med hjälp av svagt röd lysdiod (LED, 17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm) för att upprätthålla stav känslighet.
- Söva råtta genom att injicera ketamin / xylazin (60: 5 mg / kg) intramuskulärt. Bekräfta tillräcklig anestesidjupet genom frånvaron av en tass nypa reflex.
- Att upprätthålla sedering, administrera en ytterligare dos av anestesi (50% av initialdos) efter 50 minuter om så är nödvändigt.
- kommer för ytterligare lokal anestesi en droppe 0,5% proximetakain till varje öga, och blinkar bort överflödig vätska.
- För elev dilatation tillämpa en droppe 0,5% tropikamid till varje öga, sedan torka bort överflödig vätska.
- ERG och VEP elektrodpositionering
- Placera djuret på ERG plattformen framför Ganzfeld skål belägen i Faradays bur. Undvik att använda en elektrisk värmedyna, eftersom det cen införa elektriskt brus i elektrofysiologiska inspelningar. Obs: Plattformen är ansluten till en cirkuleras upphettat vatten plattform för att upprätthålla kroppstemperaturen.
- Säker djur till plattform med en remsa av krok-och-loop fästanordningen placeras stadigt men inte tätt runt nacken.
- Haka den inaktiva VEP elektroden runt bottentänderna i bedövad råtta.
- Placera ERG inaktiva elektroderna genom omger skleral ringen icke-invasivt runt ögats ekvator. Stabilisera detta genom att fästa elektroderna till hook-and-loop fästlisten runt nacken. Upprepa för den kontralaterala ögat.
- Fäst VEP aktiva elektroderna genom att fästa krokodilklämmor till rostfria skruvar i förväg implanterade på skallen.
- Placera en liten droppe av en% karboximetylcellulosa-natrium på hornhinnan före placering av ERG aktiva elektroden för att förbättra signalkvaliteten. Obs! Viskos vätska hjälper också behålla hornhinnans hydratisering under experiment för att miniMize bildandet av uttorkning-typ katarakt hos gnagare 7.
- Placera en liten droppe av en% karboximetylcellulosa-natrium på de nedre framtänderna för att förbättra kontakten av VEP inaktiva elektroden och således signalkvaliteten.
- Placera ERG aktiva elektroderna lätt röra centrala hornhinnans yta med hjälp av en mikromanipulator ansluten till en specialbyggd stereotaxic arm.
- Sätt i 2 - 5 mm från marken nålelektroden (rostfritt stål) subkutant i svansen.
- Vid behov torka överflödig vätska från sämre ögonlocket före inspelning för att förbättra signalkvaliteten.
- Skjut plattform närmare Ganzfeld skål säkerställa djurens ögon i linje med öppningen av skålen för att möjliggöra jämn belysning av både näthinnor (se steg 2.4.1).
- Stäng Faradays bur för att minska ovidkommande brus.
- Datainsamling
- Använd en mörk test blixt (- 0,52 log cd.sm -2) för att bedöma om elektrod placement är tillfredsställande 2. Under kontrollförhållanden skulle resultera i en ERG amplitud på ~ 800 μV och en inter-öga variabilitet som inte är större än 10%. Om det behövs omplacera elektroderna.
- Efter testet-flash tillåter djur till mörk anpassa för 10 minuter i fullständigt mörker före inspelningen.
- Nuvarande ljusblixtar stimuli med hjälp av en Ganzfeld skål samtidigt samla ERG och VEP signalerar samtidigt över en ~ 500 ms tidsfönster. Framsteg från dimmer till ljusare ljusnivåer för att upprätthålla tillräcklig mörk anpassning av specifika vågformer.
- Samla signaler över en rad lysande energi att framkalla STR, B-våg och A / B-våg vågformer av ERG. Genomsnittliga fler signaler vid dimmer ljusnivåer (20 upprepningar) och mindre på de ljusare ljusenergierna (1 rapport). Så småningom förlänga inter-stimulus intervall 1-180 sek från dimmest till den ljusaste ljusnivån. Se tabell 1 för ett exempel protokoll.
- till isosent ERG tappar och stavar svar utnyttja en ihopparad-flash paradigm 8. Initiera fyra blinkar på 1,52 log cd.sm -2 med en 500 ms mellan stimulus intervall 2 i-mellan. Digitalt subtrahera kon vågformen (3: e eller 4: e blixt) från den blandade vågformen (1 st blixt) för att härleda den förmodade stången svar.
- För att spela in VEP signaler, i genomsnitt 20 upprepningar på ljusare ljusenergierna (dvs. - 0,52-1,52 log cd.sm -2, 5 sek mellan stimulus intervall). Observera att den första blixten i denna sekvens returnerar den konventionella mörka anpassade ERG svar.
- Tillåt 1 - 3 min för återanpassning efter (20) VEP sveper innan nästa ljusare ERG steg, beroende på ljusenergin.
- Efter avslutad datainsamling, avliva den sövda djur med intrakardiell injektion av pentobarbitalnatrium (325 mg / ml, 3 ml).
| vågform | Stimulus ljusenergi (log cd.sm -2) | Antal upprepningar | interstimulus intervall (sek) |
| STR | -6,24 | 20 | 2 |
| STR | -5,93 | 20 | 2 |
| STR | -5,6 | 20 | 2 |
| STR | -5,33 | 20 | 2 |
| Stång b-vågen | -4,99 | 10 | 2 |
| Stång b-vågen | -4,55 | 10 | 2 |
| Stång b-vågen | -4,06 | 5 | 5 |
| Stång b-vågen | -3,51 | 5 | 5 |
| Stång b-vågen | -3,03 | 1 | 15 |
| Stång b-vågen | -2,6 | 1 | 15 |
| Stång b-vågen | -1,98 | 1 | 15 |
| Blandad a- / b-vågen | -1,38 | 1 | 30 |
| Blandad a- / b-vågen | -0,94 | 1 | 30 |
| Flash 1: Blandad a- / b-våg i genomsnitt 20: VEP | -0,52 | 20 | 5 |
| (90 sekunder innan nästa) | |||
| Flash 1: Blandad a- / b-våg i genomsnitt 20: VEP | 0,04 | 20 | 5 |
| (120 sek innan nästa) | |||
| Flash 1: Blandad a- / b-våg i genomsnitt 20: VEP | 0,58 | 20 | 5 |
| (180 sek innan nästa) | |||
| flash 1: Blandad a- / b-våg i genomsnitt 20: VEP | 1,2 | 20 | 5 |
| (180 sek innan nästa) | |||
| Flash 1: Blandad a- / b-våg i genomsnitt 20: VEP | 1,52 | 20 | 5 |
| (180 sek innan nästa) | |||
| Kon a- / b-vågen | 1,52 | 4 | 0,5 |
Tabell 1. ERG och VEP inspelning protokoll hjälp av en rad stimulans energi. Stimulans presentationer framsteg från dim (överst) till ljusa (nederst) blinkar med tillräcklig inter-stimulus intervall för att säkerställa mörk anpassning. Vid slutet av protokollet, är en upprepning av fyra blixtar med kort intervall presenteras för att framkalla konen medierat svar.
3. Analys av ERG Vågformer
Obs: ERG och VEP analys har beskrivits i detalj tidigare 3,9,10 Den.Följande avsnitt ger en kort översikt.
- Export signaler i digital spänningstidsformatet till ett kalkylprogram för dataanalys.
- Stång photoreceptoral funktion
- Model framkanten av a-våg PIII med en fördröjd Gauss (ekvation 1) 11.
PIII (i, t) = Rm PIII ∙ [1 - exp (- jag ∙ S (t - t d) 2)] för t> t d (ekvation 1) - Optimera passning över en ensemble av två ljus lysande energier 12,13 (dvs 1,22 och 1,52 log cd.sm -2).
- Modell upp till 90% av a-vågsamplitud för att undvika post receptoral intrång 14.
Obs: Modellen återgår den mättade amplitud (Rm PIII, μV), känslighet (S, m 2 .cd -1 .s -3) och fördröjning (t d, ms) i photoreceptoral svaret.
- Model framkanten av a-våg PIII med en fördröjd Gauss (ekvation 1) 11.
- Rod bipolär cell onenJon
- Digitalt subtrahera PIII modellen (se ovan) från de blandade vågformerna att återföra blandade PII med överliggande oscillerande potentialer.
- Att extrahera stången PII från den blandade PII, digitalt subtrahera kon svar (3: e eller 4: e blixt på 1,52 log cd.sm -2) från den blandade PII (1 st blixt på 1,52 log cd.sm -2).
- Sedan gäller ett lågpassfilter till vågformen (46,9 Hz, -3 dB, Blackman fönster) för att avlägsna svängnings potentialer. Den återstående vågformen är stången PII svar 10.
- Utdrag stången PII toppamplituden och plotta den mot alla stimulans intensiteter (under -2 log cd.sm -2 och stång isolerade PII på 1,52 log cd.sm -2) 10.
- Modellera dessa data med hjälp av en hyperbolisk funktion (ekvation 2), vilket ger ett mått på inre retinal cell integritet.
V (i) = V max (i n / (v+ K n)) (Ekvation 2)
Notera: Denna ekvation returnerar maximal PII respons (Vmax, μV), 1 / känslighet (k, log cd.sm-2) och lutningen av funktionen (n) 15.
- Kon bipolär cellfunktion
OBS: Eftersom kon svaret tas vid ett enda intensitet (1,52 log cd.sm -2) amplituden och timing är retuned på denna ljusnivå.- Extrahera maximal kon PII svar 2,16.
- Utdrag implicit tid som denna maximalt svar motsvarar 2,16.
- Ganglion cellfunktion
- Eftersom STR är en liten signal, tillämpa ett lågpassfilter med 50 Hz notch att vågformen för att eliminera högfrekvent och linjebrus (46,9 Hz, -3 dB, Blackman fönster).
- Extrahera maximal PSTR svar 3,17.
- Utdrag implicit tid som denna maximalt svar motsvarar 3,17.
4. Analys av VEP Vågformer
- Utdrag högsta och lägsta komponenter i VEP (P1, N1 och P2). För detaljer se referenser 3,6.
- Express amplituder som tråg till-topp-amplituder från deras föregående topp eller tråg (P1N1 och N1P2) 3,6.
- Utdrag implicit tid (det) som denna maximala svars motsvarar (P1 det, N1 det, P2 det) 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ERG a-våg (> -1,38 log cd.sm -2), b-vågor (> - 4,99 log cd.sm -2) STR (<- 4,99 log cd.sm -2) och vepsiska (> - 0,52 log cd.sm -2) registrerades samtidigt (figur 1 och 3). Vid mycket dunkla blinkar är en positiv STR (PSTR) ses vid cirka 110 msek efter blixten, och en negativ STR (nSTR) vid cirka 220 msek (figurer 1 och 2). En ERG med en stor b-vågen, toppar mellan 50 till 100 ms efter debuten av en måttlig blixt vilket kan analyseras för dess PII svar (fig 1 och 2). Vid denna stimulans energi, är den negativa a-våg innan toppen försumbar. På ljusare ljusenergier den negativa böjningen a-våg blir mer framträdande som kan kvantifieras med PIII svar (Figur 2). Den scotopic VEP vågformen visar ett negativt svar (P1N1, 15-70 ms fönster) följt av en positiv deformation (N1P2, 30 - 100 ms) (figurerna 3 och 4).
Figur 1. Grupp Genomsnittlig ERG vågformer. ERG förändrar med ökande stimulusintensitet. Siffror till vänster om vågformen indikerar ljusexponering för att framkalla vågformen. Notera de olika amplitud och tidsskalor för varje panel. Vid dimmer lysande energier kan framkallas de positiva och negativa komponenter i scotopic reaktionströskel (PSTR, nSTR). Som stimulans energier får ljusare, kan a och b-våg svar analyseras, och en ihopparad-flash paradigm tillåter könen svar som skall mätas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
pload / 54.158 / 54158fig2.jpg "/>
Figur 2. ERG-analys. (A) Rod fotoreceptorfunktion kan analyseras genom användning av en PIII för att modellera en-vågen. A-vågor vid 1,22 och 1,52 log cd.sm -2 (ofyllda cirklar, ○) är lämpliga som en ensemble med en PIII (grå linjer, ekvation 1) till 90% av den miniminivå som returnerar Rm PIII (mättad amplitud, μV) S (känslighet, m 2 .cd -1 .s -3) och td (tidsfördröjningen, ms) parametrar. (B) Rod bipolär cellfunktion (medelvärde ± SEM) kan analyseras genom att modellera intensiteten svars serie av stången PII (ofyllda cirklar ○) med Naka-Rushton funktion (grå linje). Detta returnerar Vmax (mättad amplitud, μV), k (1 / känslighet, log cd sm -2) och n (lutning). (C) retinala ganglioncellfunktion provas vid dim lysande energier och kvantifierades genom PSTR toppamplitud (PSTR amp) och timing (PSTR det (D) Cone bipolär cellfunktionen framkallas med en parade flash paradigm kvantifieras genom kon PII toppamplitud (kon PII amp) och timing (kon PII det). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Grupp Genomsnittlig VEP vågformer. Formen på VEP-vågformen förändrar med ökande stimulans energi. Siffrorna till vänster om vågformen indikerar ljusexponering för att framkalla vågformen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 4. VEP Analys och intensitet svarsfunktionen. (A) amplitud analys av VEP tas som topp till botten (P1N1) och tråg till topp (N1P2) amplituder. De implicita gånger (det) av dessa svar är också tillbaka (P1 det, N1 det, P2 det). (B) VEP P1N1 amplitud (medelvärde ± SEM) ökar med ökande stimulans energi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ERG och VEP är objektiva mått på synfunktionen från näthinnan och cortex, respektive. Fördelen med samtidig inspelning är att en mer heltäckande bild av hela visuella vägen ges. Specifikt kan den kompletterande information från sin samtidig bedömning ge en tydligare avgränsning av skadestället i den visuella vägen (t.ex. för störningar med överlappande ERG ännu distinkt VEP manifestationer 18, när optisk neuropati kan samexistera med primär cerebral atrofi 19, 20, eller när VEP förlust kan förväxlas med manifestation av skador på flera platser i visuell väg 21,22). Genom att mäta ERG och VEP samtidigt, kan ett index av vinsten mellan näthinnan och kortikala svar även härledas. Detta kan ge ett användbart verktyg för att upptäcka subtila patologiska förändringar. Det nuvarande protokollet medger ERG och VEP mätning i vanligen använda laboratorieråttor, men kan lätt vara annonsApted till andra däggdjursarter 23-25. ERG och VEP vågformer från gnagare ger en rimlig preklinisk surrogat för svar som observerats i mänskliga ögon 26-28.
Genom att utforma en specifik stimulus protokoll, kan både ERG och VEP svar erhållas under en enda inspelningssession. Tabell 1 visar en progression i ljusnivåer med lämplig hänsyn till tiden för återhämtning mellan konsekutiva blinkar. Detta protokoll ger en balans mellan behovet av att maximera signal-brus egenskaper och begränsa inspelningstiden inom anestesifönstret i en enda dos av ketamin: xylazin. Därför kan denna teknik vara användbar för en objektiv kvantitativ mätning av synfunktionen för forskning om grundläggande fysiologi och sjukdom.
En omfattande utvärdering av det visuella systemet kan åstadkommas genom att samtidigt utvärdera bilaterala retinala svar och visuellt framkallade kortikala svar. Emellertid kan varje teknik även utföras i isolering och monocularly istället för Binokulär att förenkla förfarandet. Det nuvarande protokollet beskriver scotopic ERG och VEP signaler valt att isolera stav vägen med tanke på att råttor har en stav dominerad näthinnan. Om ljusa anpassad svar är av större intresse för studien, är det också möjligt att genomföra fotopiska ERG och VEP-signaler genom att i förväg anpassning till ett bakgrundsljus.
En viktig begränsning med denna teknik är att det är nödvändigt att genomföra förfarandet enligt sövda förutsättningar för att en stabil elektrodplacering. Ändå denna metod ger robusta signal-brusegenskaper som möjliggör detektion av subtila förändringar behandling.
På grund av den lilla amplituden för STR och dess ljuskänslighet anpassning, flera steg måste observeras noggrant för att säkerställa ett framgångsrikt registrering av detta svar. För det första måste tillräckligt mörk anpassning som ska genomföras, vilket omfattarnatten mörk anpassning (≥ 8 h), elektrodplacering vid dåliga rött ljus (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm), och åter mörk anpassning efter en dunkel test blixt (10 min för - 0,52 log cd. sm -2). Vidare kan egenskaperna hos STR signal-brus förbättras genom medelvärdesbildning över flera signaler (dvs 20 signaler) uppsamlades med korta inter-stimulus intervall (dvs, 2 sek). En av fördelarna med denna omfattande utvärdering av båda ögonen och cortex är att möjliggöra jämförelse med den kontralaterala inspelningen tre. Som sådan särskild försiktighet bör iakttas i elektrodtillverkning (dvs samma storlek och formade elektroder), för att säkerställa minimal mellan öga och inter kortikala variabilitet.
Med tanke på den omfattande användningen av både ERG och VEP tekniker för att ge in vivo åtgärder av den visuella vägen och dess sjukdomsrelaterade processer, skulle det vara lämpligt att sammanställa annan väg specifika protocols (t.ex. ON / OFF eller kon subtyp specifik), och utföra samtidiga ERG / VEP inspelningar med olika stimulans formerna (t.ex. flimmer, mönster, sågtand) att utvidga tillämpningen av denna teknik i kliniska diagnoser. Ett annat logiskt steg i denna ansökan i framtiden skulle också vara att registrera ERG och VEP samtidigt från medveten 29 fritt rörliga djur för att undvika anestesi påverkan på neurala fysiologi 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
References
- Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
- Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
- Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
- Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
- Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
- Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
- Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
- Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
- Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
- Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
- Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
- Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
- Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
- Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
- Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
- Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
- Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
- Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
- Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
- Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
- Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
- Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
- Robson, J. G., Frishman, L. J.
- Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
- Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
- Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
- Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).
