Introduction
elektroretinogram (ERG) ve görsel uyarılmış potansiyel (VEP) ölçümü görsel yolunun bütünlüğü yararlı kantitatif değerlendirmeler sağlar. VEP aynı ışık olayı aşağıdaki birincil görsel kortekse retinadan görme yolları gelen fonksiyonel bütünlüğünü ölçer ERG, ışık uyarımı retinanın elektrik tepkilerini ölçer. Bu yazıda yaygın olarak kullanılan bir laboratuar modellerinde sıçan kayıt ve ERG ve VEP cevapların analizi için bir protokol açıklamaktadır.
ERG bir ışık yanıp sönmeye retinanın brüt elektrik tepkisini miktarının tarafından anahtar retinal hücre sınıfları bir dizi fonksiyonel bütünlüğünün bir dizin sağlar. iyonik akıların koordineli dizi ışık başlangıçlı tarafından başlatılan ve ofset, gözün dışına yerleştirilen yüzey elektrotlar kullanılarak ölçülebilir voltaj saptanabilir değişiklikler üretirler. Elde edilen dalga bir se birleşimini temsilgenlik, zamanlama ve sıklığı farklılık iyi tanımlanmış bileşenlerin Ries. Araştırmanın önemli bir vücut bu bileşenler, nispeten iyi bir çok omurgalı retinae boyunca ve parçaları birbirinden ayrılabilir olduğu korunmuş olduğunu göstermiştir. Mantıklı uyaran (flaş uyarı, arka plan, interstimulus aralık) koşulları seçme ve analiz etmek için kompozit dalga belirli özelliklerini seçerek bir retina hücrelerinin 1,2 belirli bir grubun bir ölçü dönen emin olabilirsiniz. Bu özellikler yarar ve dolayısıyla retina fonksiyonunun bir non-invaziv bir önlem olarak ERG yaygın uygulamaları altında yatan. Bu yazının (pozitif ERG ölçme ve retinada önemli hücre sınıfları, yani fotoreseptör (PIII bileşeni), bipolar hücreleri (PII bileşeni) ve retina ganglion hücrelerinin bazıları hakkında bilgi dönmek için özelliklerini analiz etmek için metodoloji üzerinde duruluyor scotopic eşik yanıt veya pSTR).
3 alan V1 optik sinir, optik sistemi, talamus (lateral genikulat nükleus, LGN) ve optik radyasyon yoluyla seri iletilecektir. Kemirgenlerde, çoğunluk - Her göz decussate 4'ten optik sinir liflerinin (90% 95) ve kontralateral orta beyin innerve. ERG aksine, 5 ve böylece görsel yolu VEP dalga formunu etkileyebilecek herhangi bir yerde birlikte değişir, özel hücre sınıflar için VEP farklı bileşenlerini atfedilmesi henüz mümkün değildir. Bununla birlikte, VEP görsel performans ve görsel yolu bütünlüğü yararlı bir non-invaziv bir ölçüsüdür. VEP, ERG ile bağlantılı olarak kullanıldığında, görme sistemi (örneğin, retina / işitsel yol) daha tam bir değerlendirmesini sağlar.
ERG ve VEP kayıtları başvurunun bağlı olarak, tek başına ya da kombinasyon halinde yapılabilirkatyon. Bu yazıda anlatılan metodoloji retina ve kortikal görsel uyarılmış hem gözlerden elektrofizyoloji ve anestezi farelerde her iki yarımkürede aynı anda değerlendirilmesini sağlar. Bu daha kapsamlı retina fonksiyon değişiklikleri görsel uyandırılmış kortikal fonksiyonu olabilir ki retina fonksiyonu ve yukarı etkilerini değerlendirmek için kullanışlı bir yoldur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deney prosedürleri Avustralya'da Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından belirlenen Bakım ve Bilimsel Amaçlarla Hayvanların Kullanım Uygulama Avustralya Kanunu göre yapılmıştır. Etik boşluk Melbourne Üniversitesi, Fen Fakültesi, Hayvan Etik Komitesi (Onay numarası 0.911.322,1) elde edilmiştir.
Kronik VEP Elektrotların 1. Ön-implantasyon
Not: eşzamanlı ERG ve VEP sinyallerinin ameliyatla VEP implante edilmesi gereken hayvanların en az 1 hafta koleksiyonu sinyal önce elektrotlar toplanacak edin.
- klorheksidin (% 70 etanol içinde% 0.5) ile temizlenerek önce deney cerrahi tezgah sterilize edin. Kullanmadan önce tüm cerrahi ekipman Otoklav. steril bir cerrahi örtü ile hayvan örtün. Tüm Deneyciler cerrahi maske, önlük ve sterilize eldiven giymek emin olun.
- 3 L / dakikalık bir akış oranında O2 ile% 3.5 izofluran - 3 anestezi neden. ane korumakameliyat boyunca% 1.5 ve 2 L / dakika sthesia. pençe tutam refleksinin yokluğu ile anestezi yeterli derinlik sağlamak.
- gözlerin kurumasını önlemek için kornea% 1 karboksimetilselüloz sodyum uygulanır.
- Gözleri, alnının üzerine posterior 30 mm x 30 mm alanı Tıraş ve kulaklara ön.
- vücut ısısını korumak ve bir stereotaksik çerçeve ile hayvanların başını stabilize etmek için bir ısı yastığı (37 ˚C) hayvan koyun.
- % 10 povidon-iyot üç kez traş bölgeyi dezenfekte edin. Uygulama Standardı ile uyumlu olmak, gözün yakın bölge için alkol bazlı antiseptik kullanmaktan kaçının Cerrahi Teknologları Derneği tarafından yola çıktı.
- kranial kemik açığa çıkarmak için bir neşter ile ve dermal doku bu tüketim a ~ 20 mm çaplı daire gelen kafasına bir medyan sagital kesi olun.
- kazıma ve koronal ve sagital kafatası sütür ortaya çıkarmak için gazlı bez ile kurutularak yatan periosta çıkarın.
- Bize7 mm kaudal bregma, orta hatta 3 mm yanal: stereotaksik koordinatlar her iki hemisferde üzerinde kafatası yoluyla iki delik (0.7 mm çap, derinlik ~ 1 mm) Trepan, bir matkap bağlı bir diş çapak ing.
- Paslanmaz çelik vida Vida (çap 0.7 mm, klorheksidin sterilize uzunluk 3 mm) yaklaşık 1 mm (maruz vidanın 2 mm) derinliğe kadar, iki önceden hazırlanmış deliklere sıkı demirleme izin vermek. Altta yatan kortikal doku zarar vermeden bu kişiler dura.
- ~ 4 ve 8 saat 0 sütür - gazlı bez ile kranial kemik kurutma ve iki 3 gevşek cilt geri çekilerek diş amalgam cerrahi zemin hazırlayın.
- yerine (adım 1.10 açıklanan paslanmaz çelik vidalar) vida elektrotlar güvenli maruz kafatası üzerinde diş amalgam yayıldı. ~ Vida 1,5 mm kayıt için maruz kalır emin olun.
- Geri çekme dikişlerle çıkarın.
- analjezi ve tuzlu su (sodyum klorür,% 0.9, 1, 0.5,% karprofen deri altından (5 mg / kg) enjektesıvı replasmanı için 0,5 ml) deri altından.
- Hayvan ayrı kafeslerde kurtarmak için izin verin. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın.
- tamamen cerrahi (en az 5 gün) kurtarıldı kadar diğer hayvanların şirkete hayvan iade etmeyin.
- 4 gün için% 0.5, günde bir kez analjezi için karprofen deri altından (5 mg / kg) tatbik devam edin.
- Kayıt ERG ve VEP cerrahisi sonrası 1 hafta.
2. ERG ve VEP Kayıt
- Veri toplama hazırlığı
- Aynı anda uyaran tetiklemek ve aşağıda tavsiye edilen ayarlara göre verileri 2 elde etmek için bilgisayar yazılımını kullanın.
- Sinyaller 3 yükseltmek (ERG: 1.000, VEP ×: x10,000) içten izole bir ön amplifikatör ve amplifikatör tarafından belirlenen kazanç ve empedans açısından eşleştirilmiş iki gözü.
- Bir 650 üzerinde 4 kHz ERG için ayarlayın örnekleme oranımsn kayıt penceresi (2560 puan) Bunu yapmak için, "500 ms" Örnekler için "2.560" i seçin ve (isim ve Malzeme yazılım bkz Tablo sürümü için) veri toplama yazılımı "zaman tabanı" sekmesini tıklayın bir süre için 650 msn kayıt penceresi dönecektir hangi.
- 250 milisaniye çağ boyunca 10 kHz VEP için örnekleme oranını ayarlamak için aynı yöntemi kullanın. hem ERG ve VEP kayıtları için 10 msn öncesi uyaran taban çizgisini izin verin. Bunu yapmak için, "Kur" sekmesine tıklayın; Yeni bir diyalog penceresini açın "Stimülatörü" seçeneğini seçin; Bu pencerede "Mode" için açılır listeden "darbe" seçeneğini seçin; ve "10 ms" için "gecikme" için değerini ayarlayın.
- 1000 Hz (- - 3 dB) 0.3 filtreleme Set ERG bant geçiren. Bu veri toplama yazılımı "Bio Amplifikatör" tıklayarak yapılır. Sonra, "0.3Hz" "Yüksek Pass" değeri ve "düşük geçiş" için "1 kHz için değerini ayarlayın".
- 100 Hz - (- 3 dB) Vizyon (ISCEV) Klinik Elektrofizyoloji Uluslararası Derneği tarafından önerilen insan VEP kayıtları 6 2.1.1.3'de yukarıda belirtilen yöntemi kullanarak, 0.1 ile VEP bant geçiren ayarlarını.
- Aynı anda uyaran tetiklemek ve aşağıda tavsiye edilen ayarlara göre verileri 2 elde etmek için bilgisayar yazılımını kullanın.
- elektrot hazırlığı
- Sırasıyla 2, bir elektrot kurşun gümüş tel ya da bir timsah klibi takarak ERG aktif / pasif ve VEP aktif / pasif elektrotlar özel yapmak. Ticari olarak toprak elektrot edinin.
- 4 ısmarlama elektrotlar için elektrot kurşun uzantısından erkek ucunu kesti. İç tel sağlayan bir neşter bıçak hasarlı olup dış politetrafluoroetilen yalıtım kaplama 1 cm kaldırın.
- Ön moda sıçan göz kuşatmak için çapında bir döngü ~ 8 mm gümüş tel (0.3 mm kalınlığında) bir 70 mm uzunluk kesme ve şekillendirme ile ERG inaktif elektrotlar. 1 ml pipet ucu ile ilgili döngü şekillendirilmesiyle tek tip bir daire hazırlayın.
- Ön moda gümüş tel 30 mm uzunluk kesme ve yavaşça sıçan kornea temas için küçük bir döngü oluşturarak ERG aktif elektrotlar (~ çapı 1-2 mm)
- Güvenli maruz iç tel ile gümüş entwining ile (2 2 ERG inaktif aktif ERG, 1 VEP inaktif) elektrot kurşun elektrotlar ekleyin.
- fotovoltaik eserler azaltmak için maskeleme bandı ile aşırı maruz metal izole.
- ERG inaktif elektrotlar kanca ve halka raptiye küçük bir parça sopa üzerinde (~ 20 mm x 5 mm) maskeleme bandı ile kemirgen boyun askısı kararlı eki sağlamaktır.
- elektrodun iç teline timsah klibi takın VEP aktif elektrotlar yapmak açar.
- Önceki kayıtları, gümüş tellerin açıkta kalan yüzeyleri (yani, inaktif halka ve acti electroplateSinyal iletimi geliştirmek için 20 saniye boyunca bir 9 V DC kaynağı kullanılarak klorür ile ucu) A.Ş..
- Bunu yapmak için, normal tuzlu su içinde (birincil hücre anot olarak hareket eden) ERG elektrot teli gümüş ucu bırakın; 9 V pil pozitif terminaline bu elektrot teli diğer ucunu.
- akünün eksi kutbuna başka kabloyu (katot) bağlayın, ve aynı zamanda tuzlu su içine diğer ucunu batırmayın. 20 saniye sonra çıkarın ve beyaz renkte eşit kaplanacak ERG elektrot teli şerit ucunu görüyoruz.
Not: klorür kaplama açıklığını sağlamak için (~ kadar 8 saat kadar) Her bir deneysel oturumda için yeni ERG elektrotlar hazırlayın.
- Hayvan hazırlanması
- Bir ışık geçirmez bir odaya önceki kayıtları hayvanları gecede (≥ 8 saat) Koyu adapte. , Oda ışıkları kapatarak tüm kapıları ve güneşlikler kapatarak maksimum karanlık adaptasyonu sağlamak. etrafında ışık geçirmez malzemeler koyarak ışık sızıntısını en aza indirmekkalın siyah perdeler dışında kapı / pencere ve yerleştirme bilgisayar ekranları kavşaklar.
- Loş kırmızı ışık yayan diyot yardımıyla karanlık bir odada hayvan hazırlık yapmak (LED, 17.4 cd.m -2, λ max = 600 nm) çubuk hassasiyeti sürdürmek için.
- kas içinden (5 mg / kg 60) ketamin / ksilazin enjeksiyonu ile sıçan anestezisi. Bir pençe tutam refleksinin yokluğu ile anestezi yeterli derinliği onaylayın.
- , Sedasyon muhafaza gerektiğinde 50 dakika sonra anestezi bir başka doz (başlangıç dozunun% 50) idare etmek.
- Ek topikal anestezi için her göze% 0.5 Proxymetacaine bir damla uygulamak ve fazla sıvıyı kapalı yanıp söner.
- öğrenci dilatasyon daha sonra, her bir göze% 0.5 tropikamid bir damla uygulamak aşırı sıvı kapalı kuru.
- ERG ve VEP elektrot konumlandırma
- Faraday kafesi bulunan Ganzfeld kase önünde ERG platformunda hayvan yerleştirin. bu c gibi bir elektrikli ısıtma yastığı kullanmaktan kaçınınBir elektrofizyolojik kayıtlar, elektrik gürültüsü tanıtmak. Not: Platform vücut ısısını korumak için bir devridaim ısıtılmış su platformuna eklenir.
- ense etrafında sıkıca sıkı değil yerleştirilmiş kanca ve halka raptiye bir şerit ile platforma güvenli bir hayvan.
- anestezi sıçan alt kesici etrafında inaktif VEP elektrot kanca.
- Gözün ekvator çevresinde non-invaziv skleral halka çevreleyen ile ERG inaktif elektrotlar yerleştirin. ense civarında kanca ve halka raptiye şeridine elektrotlar takarak bu stabilize. kontralateral göz için tekrarlayın.
- Sabitleyin VEP paslanmaz çelik vidalı kafatası önceden implante için timsah klipleri ekleyerek aktif elektrotlar.
- Sinyal kalitesini artırmak için önce ERG aktif elektrodun yerleştirme kornea üzerinde% 1 karboksimetilselüloz sodyum küçük bir damla yerleştirin. Not: viskon sıvısı ayrıca mini deney boyunca kornea hidrasyon korumak yardımcı olurkemirgenler 7 kuruma tipi katarakt oluşumunu rımızı azamiye.
- VEP inaktif elektrot teması artırmak için alt ön dişlerin% 1 karboksimetilselüloz sodyum küçük bir damla koyun ve böylece kaliteyi işaret etmektedir.
- hafif özel bir dahili stereotaksik kol bağlı bir mikromanipülatör kullanarak santral kornea yüzeyine dokunmak ERG aktif elektrotlar yerleştirin.
- subkutan kuyruk içine toprak iğne elektrot (paslanmaz çelik) 5 mm - 2 yerleştirin.
- Gerekirse alt göz kapağında önceden sinyal kalitesini artırmak için kayıt için herhangi bir aşırı sıvı kurutun.
- yakın hayvanın gözleri, her iki retina bile aydınlatılmasını sağlamak için kase açılması ile uyum sağlanması Ganzfeld kaseye slayt platformu (adım 2.4.1 bakınız).
- dıştan gelen sesleri azaltmak için Faraday kafesi kapatın.
- Veri koleksiyonu
- Elektrot Yerleşi olmadığını değerlendirmek için - (0.52 log cd.sm -2) loş bir test flaş kullanmakent 2 tatmin edicidir. Kontrol koşulları altında, bu ~ 800 uV bir ERG genlik ve 10'dan büyük olmayan,% arası bir göz değişkenlik olmasına neden olur. Gerekli repozisyon elektrotlar edin.
- Test flaş aşağıdaki hayvanların kayıttan önce tam karanlıkta 10 dakika süreyle koyu adapte sağlar.
- ERG ve VEP'in toplarken bir Ganzfeld kase kullanarak ışık uyaranların mevcut yanıp söner ~ 500 msn zaman penceresi üzerinden aynı anda sinyal gönderir. sönük gelen İlerleme belirli dalga formları için yeterli koyu uyumlarını sağlamak amacıyla ışık düzeylerini daha parlak.
- STR, B-dalga ve ERG a / b-dalgası dalga biçimleri ortaya çıkarmak için aydınlık enerjilerin aralığında sinyalleri toplamak. parlak ışıklı enerjilerin (1 tekrar) de kısık ışık seviyelerinde (20 tekrarlar) ve daha az ortalama daha sinyaller. Yavaş yavaş 1 dimmest gelen parlak ışık seviyesine 180 sn arası uyaran aralığı uzatmak. Bir örnek protokolü için Tablo 1'e bakınız.
- iso içinGeç ERG çubuk ve koni yanıtları, bir eşleştirilmiş-flaş paradigma 8 kullanmaktadır. 1.52 log cd.sm dört yanıp başlatmak -2-arasında 500 milisaniye arası uyaran aralığı 2 ile. Dijital varsayılan çubuk yanıtı elde etmek için karışık dalga (1. flaş) için koni dalga formu (3. veya 4. flaş) çıkarın.
- Parlak ışıklı enerjilerde VEP sinyalleri, ortalama 20 tekrarlar kaydetmek için (yani, - 0,52 log cd.sm -2, 5 sn arası uyaran aralığı 1,52). Bu dizideki ilk flaş geleneksel koyu adapte ERG tepki verdiğini unutmayın.
- (20) VEP aydınlık enerjiye bağlı olarak, bir sonraki daha parlak ERG aşamasından önce süpürür sonra yeniden uyarlanması için 3 dakika - 1 izin verin.
- Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, pentobarbital sodyum (325 mg / ml, 3 mi) intrakardiyak enjeksiyonu ile, anestezi verilen hayvanın euthanize.
| Dalga şekli | Uyarıcı ışık enerjisi (cd.sm log -2) | Tekrar sayısı | interstimulus aralığı (sn) |
| STR | -6,24 | 20 | 2 |
| STR | -5,93 | 20 | 2 |
| STR | -5.6 | 20 | 2 |
| STR | -5,33 | 20 | 2 |
| Çubuk b-dalgası | -4,99 | 10 | 2 |
| Çubuk b-dalgası | -4,55 | 10 | 2 |
| Çubuk b-dalgası | -4,06 | 5 | 5 |
| Çubuk b-dalgası | -3,51 | 5 | 5 |
| Çubuk b-dalgası | -3,03 | 1 | 15 |
| Çubuk b-dalgası | -2.6 | 1 | 15 |
| Çubuk b-dalgası | -1,98 | 1 | 15 |
| Karışık a- / b-dalgası | -1,38 | 1 | 30 |
| Karışık a- / b-dalgası | -0,94 | 1 | 30 |
| Flaş 1: 20 Karma a- / b-dalgası Ortalama: VEP | -0,52 | 20 | 5 |
| (Bir sonraki önce 90 sn) | |||
| Flaş 1: 20 Karma a- / b-dalgası Ortalama: VEP | 0.04 | 20 | 5 |
| (Bir sonraki önce 120 sn) | |||
| Flaş 1: 20 Karma a- / b-dalgası Ortalama: VEP | 0.58 | 20 | 5 |
| (Bir sonraki önce 180 sn) | |||
| Flash 1: 20 Karma a- / b-dalgası Ortalama: VEP | 1.2 | 20 | 5 |
| (Bir sonraki önce 180 sn) | |||
| Flaş 1: 20 Karma a- / b-dalgası Ortalama: VEP | 1.52 | 20 | 5 |
| (Bir sonraki önce 180 sn) | |||
| Koni a- / b-dalgası | 1.52 | 4 | 0.5 |
Stimulus Enerji bir Aralığı Kullanarak Tablo 1. ERG ve VEP Kayıt Protokolü. Yeterli arası uyaran aralığı ile parlak (alt) yanıp söner, loş (üstte) den Uyarıcı sunumları ilerleme karanlık adaptasyonu sağlamak. Protokolün sonunda, kısa aralıklarla dört flaş tekrarlama koni aracılı yanıtı ortaya çıkarmak amacıyla sunulmuştur.
ERG Dalga 3. Analizi
Not: ERG ve VEP analizi daha önce detaylı bir şekilde tarif edilmiştir 3,9,10.Aşağıdaki bölümlerde kısa bir bakış sağlar.
- Veri analizi için bir elektronik tablo yazılımı dijital voltaj zaman biçiminde ihracat işaretleri.
- Çubuk photoreceptoral fonksiyonu
- Gecikmiş bir Gauss (Eşitlik 1) 11 ile dalga PIII ön kenarını Model.
PIII (i t) = Rm PIII ∙ [1 - exp (- ı, S (t ∙ - td) 2)] t> T D (Denklem 1) - İki parlak parlak enerjilerin bir topluluk üzerinde 12,13 (yani, 1.22 ve 1.52 log cd.sm -2) uygun optimize edin.
- A-dalga genliği% 90 Model yukarı sonrası receptoral müdahalelerine 14 önlemek için.
Not: Model photoreceptoral yanıt doymuş genliği (Rm PIII, mV), duyarlılık (S m 2 .cd -1 .s -3) ve gecikme (t d, msn) döndürür.
- Gecikmiş bir Gauss (Eşitlik 1) 11 ile dalga PIII ön kenarını Model.
- Çubuk bipolar hücre fonksiyonuiyon
- Dijital örten salınım potansiyelleri ile karışık PII dönmek karışık dalga formlarından PIII modeli (yukarıya bakınız) çıkarın.
- Karışık PII gelen çubuk PII ayıklamak için, dijital karışık PII gelen koni yanıtı (3. ya da 1.52 log cd.sm de 4. flaş -2) çıkarma (1.52 log cd.sm 1 st flaş -2).
- Ardından, salınım potansiyelleri kaldırmak için dalga (46.9 Hz, -3 dB, Blackman pencere) bir low-pass filtre uygulamak. Kalan dalga çubuk PII yanıtı 10'dur.
- Çubuk PII tepe genliği Özü ve 10 (1.52 log cd.sm -2 az -2 log cd.sm -2 ve çubuk izole PII altında) tüm uyaran şiddetleri karşı komplo.
- iç retinal hücre bütünlüğünün bir ölçü sağlayan bir hiperbolik fonksiyonu (Denklem 2) kullanarak bu verileri Model.
V (I) 'in V max = (i n / (i n+ K n)) (Denklem 2)
Not: Bu denklem maksimal PII yanıtı (V max, mV), 1 / duyarlılık döner ve fonksiyonu (n) 15 eğimi (k, cd.sm-2 log).
- Koni bipolar hücre fonksiyonu
Not: koni yanıtı tek bir yoğunlukta alınır gibi (1.52 log cd.sm -2) genlik ve zamanlama bu ışık seviyesinde döndürülür.- Maksimal koni PII yanıtı 2,16 ayıklayın.
- Bu maksimal yanıt 2,16 karşılık gelen örtülü zaman ayıklayın.
- Ganglion hücre fonksiyonu
- STR küçük bir sinyal olarak, yüksek frekans ve hat gürültüsünü ortadan kaldırmak için Dalga formu 50 Hz çentik ile bir alçak geçiren filtre uygulamak (46.9 Hz, -3 dB, Blackman pencere).
- Maksimal pSTR yanıtı 3,17 ayıklayın.
- Bu maksimal yanıt 3,17 karşılık gelen örtülü zaman ayıklayın.
4. AnaVEP Dalga lizizi
- VEP (P1, N1 ve P2) maksimum ve minimum bileşenlerinin ekstre edilmesi. Detay için başvurular 3,6 bakın.
- Onların önceki zirve ya da çukur (P1N1 ve N1P2) 3,6 den oluk-tepe genlikleri olarak Ekspres genlikleri.
- Örtülü zaman (o) Ayıklama hangi bu maksimal yanıt karşılık gelir (P1 o N1 o, P2) 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ERG bir dalga (> -1,38 log cd.sm -2), b-dalgaları (> - 4.99 log cd.sm -2) oran otozomal STR'lerle (<- 4.99 log cd.sm -2) ve VEP (> - 0.52 cd.sm log -2) eş zamanlı olarak (Şekil 1 ve kaydedilmiştir 3). Çok loş yanıp söner anda, pozitif STR (pSTR) 110 msn flaş sonra yaklaşık görülen ve yaklaşık 220 ms bir negatif STR (nSTR) (Şekil 1 ve 2). Büyük bir b-dalgası olan bir ERG, kendi kimlik bilgileri yanıt analiz edilebilir bir orta dereceli flaş başlamasından sonra 50 ila 100 milisaniye arasındaki zirveler (Şekiller 1 ve 2). Bu uyarıcı enerjisinde, zirve öncesi olumsuz bir dalga yok denecek kadar azdır. Parlak ışıklı enerjilerin negatif sapma bir dalga PIII yanıt (Şekil 2) ile ölçülebilir hangi daha belirgin hale gelir. ardından -; skotopik VEP dalga olumsuz yanıt (70 msn penceresi 15 P1N1) gösterir Pozitif sapma (N1P2, 30-100 ms) (Şekiller 3 ve 4).
Şekil 1. Grup Ortalama ERG Dalga Şekilleri. ERG uyaran yoğunluğunu artan değiştirir. dalga solundaki sayılar dalga biçimini ortaya çıkarmak için kullanılan ışık maruziyeti gösterir. Her panel için farklı bir amplitüd ve zaman ölçekleri edin. sönük ışık enerjilerde skotopik eşik tepkisi olumlu ve olumsuz bileşenleri (pSTR, nSTR) elde edebilir. Uyarıcı enerjileri daha parlak olsun, a ve b-dalgası tepki analiz edilebilir ve bir eşleştirilmiş-flaş paradigma koni tepkisi ölçülecek verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Güncelle / 54158 / 54158fig2.jpg "/>
Şekil 2. ERG analizi. (A), çubuk fotoreseptör işlevi dalga modeli, bir PIII kullanılarak analiz edilebilir. 1.22 ve 1.52 log cd.sm A-dalgaları -2 (doldurulmamış çevreler, ○) Rm PIII döndüren en az% 90 bir PIII ile bir topluluk (gri çizgiler, Denklem 1) olarak uyum vardır (doymuş genlik, mV) S (duyarlılık, m 2 .cd -1 .s -3) ve td (zamanlama gecikmesi, msn) parametreleri. (B) çubuk bipolar hücre fonksiyonu (± SEM ortalama) çubuk PII yoğunluğu tepki serisi modelleyerek denenebilir bir Naka-Rushton fonksiyonu (gri hat) ile (doldurulmamış çevreler ○). Bu V max (doymuş genlik, mV), k (1 / hassasiyet, log cd sm -2) ve n (eğim) döndürür. (C) Retina ganglion hücre fonksiyonu loş ışıklı enerjilerde tahlil ve pSTR tepe genlik tarafından ölçülür (pSTR amp) ve zamanlaması (o pSTR (D) Koni bipolar hücre fonksiyonu koni PII tepe genlik (koni PII amp) ve zamanlama (koni PII o) ile sayısal bir eşleştirilmiş flaş paradigma ile ortaya edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Grup Ortalama VEP Dalga Formları. VEP dalga şekli uyaran artan enerji ile değiştirir. Dalga solundaki sayılar dalga biçimini ortaya çıkarmak için kullanılan ışık maruziyeti gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Figu4. VEP Analiz yeniden ve Yoğunluk Tepki Fonksiyonu. (A) VEP Genlik analizi (P1N1) dip zirve olarak alınır ve (N1P2) genlikleri zirveye çukur olduğunu. Bu tepkilerin örtülü kez (o) da döndürülür (P1 o, N1 o, P2). (B) VEP P1N1 genliği (ortalama ± SEM) uyaran artan enerji artar. Daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız bu figür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ERG ve VEP sırasıyla, retina ve korteks, görsel fonksiyonun objektif önlemlerdir. Eş zamanlı kayıt avantajı tüm görsel yolunun daha kapsamlı bir görünüm elde olmasıdır. Özellikle, onların eş zamanlı değerlendirmesinden tamamlayıcı bilgiler, örneğin optik nöropati birincil serebral atrofi 19 ile birlikte var olabilir, ERG henüz belirgin VEP 18 tezahürleri örtüşen bozukluklar için (görsel yolunda yaralanma bölgesinde daha net bir sınırlandırılmasını sağlayabilir, 20 veya VEP kaybı) görsel yolunda 21,22 çeşitli yerlerde yaralanma tezahürü ile şaşırmış olabilir zaman. eş zamanlı olarak ERG ve VEP'in ölçerek, retina ve kortikal yanıt arasındaki kazanç bir indeks de elde edilebilir. Bu ince patolojik değişiklikleri belirlemek için yararlı bir araç sağlayabilir. Geçerli protokol yaygın olarak kullanılan laboratuvar sıçanlarda ERG ve VEP ölçümü için izin verir ama kolayca reklam olabilirDiğer memeli türlerine 23-25 Apted'in. Kemirgenler ERG ve VEP dalga insan gözü 26-28 gözlenen tepkiler için makul bir preklinik vekil sağlar.
Belirli bir uyarıcı protokolü tasarlayarak, hem ERG ve VEP yanıtı tek bir kayıt oturumu sırasında elde edilebilir. Tablo 1 ardışık yanıp söner arasındaki iyileşme süresi uygun dikkate alınarak ışık seviyelerinde bir ilerleme göstermektedir. ksilizin: Bu protokol, sinyal-gürültü karakteristikleri maksimize etmek ve ketamin tek doz tarafından sağlanan anestezi pencere içinde kayıt süresini sınırlamak için ihtiyaç arasında bir denge sağlar. Bu nedenle, bu teknik, temel fizyoloji ve hastalık ile ilgili araştırma için görme fonksiyonunda bir amacı niceliksel ölçümü için yararlı olabilecektir.
görme sisteminin kapsamlı bir değerlendirme eşzamanlı bilateral retina yanıtları ve görsel uyarılmış kortikal cevapları değerlendirerek elde edilebilir. Ancak, her teknik ayrıca izolasyon yapılan ve prosedürü kolaylaştırmak yerine binoküler bir monocularly edilebilir. Geçerli protokol sıçanlar bir çubuk-egemen retina sahip olduğu göz önüne alındığında çubuk yolu izole etmek için seçilmiş scotopic ERG ve VEP sinyalleri açıklar. Işık uyarlanmış cevaplar çalışmaya büyük ilgi ise, bir arka plan ışığı öncesi adaptasyon tarafından Fotopik ERG ve VEP sinyallerinin yapmak da mümkündür.
Bu tekniğin bir önemli sınırlama kararlı elektrot yerleştirme etkinleştirmek için anestezi şartlar altında prosedürü yapılması ihtiyacıdır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, ince işleme değişikliklerin saptanmasını sağlayan güçlü bir sinyal-gürültü özellikleri sağlar.
Nedeniyle STR ve hafif adaptasyon duyarlılığı küçük genlik, birkaç adım yakından bu yanıtın başarılı kaydedilmesini sağlamak için uyulması gerekmektedir. Birincisi, yeterli karanlık adaptasyonu içeren, uygulanması gereken0.52 log cd - loş bir test flaş (10 dk için aşağıdaki gecede koyu loş kırmızı ışık altında adaptasyon (≥ 8 saat), elektrot yerleştirme (17.4 cd.m -2, λ max = 600 nm) ve yeniden karanlık adaptasyonu. SM-2). Ayrıca, STR sinyal-gürültü karakteristikleri birden fazla sinyal üzerinden ortalama geliştirilebilir (örneğin, 20 sinyalleri) kısa arası uyaran aralıklarla (yani 2 sn) ile toplanmıştır. Gözleri ve korteks hem de bu kapsamlı değerlendirme avantajlarından biri kontralateral kayıt 3 karşılaştırma sağlamaktır. Böyle, özellikle bakım elektrot yapımında (yani, aynı büyüklükte ve şekilli elektrotlar) alınması gerektiği gibi, minimal arası göz ve inter-kortikal değişkenliği sağlamak.
Görsel yolunun ve hastalıkla ilgili süreçlerin in vivo önlemler sağlamak için hem ERG ve VEP tekniklerinin geniş kullanım göz önüne alındığında, diğer yolu özgü p harmanlamak için yararlı olacaktırrotocols (örneğin, ON / OFF veya koni alt türü özgü) ve klinik tanılar bu tekniğin uygulama genişletmek için farklı uyaran yöntemleri (örneğin, titreşimsiz, desen, testere dişi) ile eş zamanlı ERG / VEP kayıtları gerçekleştirin. Gelecekte bu uygulamanın başka mantıklı bir adım da nöral fizyolojisi 30 anestezik etkileri önlemek için hayvanların serbestçe hareket eden, bilinçli 29'dan eş zamanlı olarak ERG ve VEP'in kayıt olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
References
- Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
- Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
- Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
- Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
- Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
- Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
- Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
- Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
- Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
- Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
- Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
- Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
- Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
- Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
- Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
- Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
- Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
- Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
- Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
- Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
- Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
- Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
- Robson, J. G., Frishman, L. J.
- Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
- Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
- Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
- Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).
