This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.
This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.
Während der Schwangerschaft, die Plazenta Cytotrophoblastenzellen, die einkernigen Stammzellen sind, rasch vermehren und in entweder Villi oder extravillösen Cytotrophoblastenzellen unterscheiden. Extravillösen Cytotrophoblasten eindringen und die Spiralarterien der Uteruswand umbauen. Villöse Zytotrophoblasten, andererseits weiter zu vermehren, differenzieren und Sicherung kernige Synzytiotrophoblasten (Synzytium) 1 zu bilden. Die Aufrechterhaltung der Villi trophoblast Homöostase ist von wesentlicher Bedeutung für die fetale Wohlbefinden und gesunde Schwangerschaft. In der Tat erlauben villous Trophoblasten Mutter und Fötus Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen und produzieren wesentliche Hormone für die Schwangerschaft. Darüber hinaus ist die Synzytiotrophoblasten die einzige Zelltyp in direktem Kontakt mit dem mütterlichen Blutkreislauf und stellt eine wesentliche physikalische und immunologische Barriere. Daher ist die Synzytiotrophoblasten muss Apoptose und Ersatz für homeostatic Wartung zu unterziehen und zu Avoid Plazenta Pathologien 2-5.
Die Technik entwickelt von Kliman et al. 6 1986 primären villous Cytotrophoblasten aus menschlichen Plazenten zu isolieren , führte zu einer Revolution in der Plazenta Forschung durch die Untersuchung der molekularen Mechanismen ermöglicht in villous trophoblast Differenzierung beteiligt. Diese klassische Technik, basierend auf sequentiellen enzymatischen Aufschluss mit Trypsin und DNase, gefolgt von der Isolierung in Dichtezentrifugation Medien (kolloidalen Silicapartikel durch Polyvinylpyrrolidon beschichtet oder Percoll) wird nun als Goldstandard zur Isolierung von Villi Cytotrophoblastenzellen erkannt. Die Technik kann durch eine magnetische Immun optimiert werden, ein Verfahren, das villöse Zytotrophoblasten aus nicht-trophoblastischen Zellen basierend auf der differentiellen Expression spezifischer Antigene auf den Oberflächen dieser Zellen trennt. Wir wählten das Human-Leukozyten-Antigen-ABC (HLA-ABC) wegen des Fehlens seiner Expression auf der Zell trophoblastic membrane 7,8.
Die Plazenta ist ein Organ, das dramatische Veränderungen in der Sauerstoffspiegel während der Schwangerschaft erfährt. Im ersten Trimester ist die Sauerstoffanreicherungsverhältnis physiologisch sehr gering (2% O 2) , jedoch erhöht sich auf milde Ebenen der Oxygenierung (8% O 2) in der zweiten und dritten Trimester. Tuuli et al. 9 beschrieben , dass die In – vitro – Vermehrung des Trophoblasten Umgebung innerhalb des Plazentazotten ist eine Herausforderung und Variationen der Sauerstoffversorgung Ebenen sogar zu phänotypischen Veränderungen führen kann. Es ist daher, 8% Sauerstoff zu ergreifen vorgeschlagen als Normoxie die Sauerstoffspannung in Plazentazotten während des dritten Trimesters der Schwangerschaft 8,9 zu imitieren. Chen et al. 10 untersucht umfassend mehrere Variablen Sauerstoffspannung in Trophoblasten – Zellkultur verwandt und zeigen die Bedeutung Sauerstoff – Niveaus in einer perizellulären Umgebung zu bestimmen. Die Konzentrationen von Sauerstoff in den Zotten tendenziell zunehmenaufgrund Vaskulogenese. Der Blutfluss in Plazentazotten steigt ständig und das Niveau von Wasserstoffperoxid (eine häufig vorkommende reaktive Sauerstoffspezies) ist ein wichtiges Signal , das Vaskulogenese 11,12 steuert. In Schwangerschaftskomplikationen, erzeugt ein Mangel an Vaskulogenese Hypoxie, und noch wichtiger, intermittierende Variationen der Oxygenierung (sogenannte Hypoxie / Reoxygenierung). Diese Bedingungen führen zu einer abnormen Erhöhung des oxidativen Stress, der Plazenta und fetale Lebensfähigkeit 13,14 kompromittiert. Die Veränderungen , die Trophoblasten – Zellen in vivo während Episoden von Hypoxie / Reoxygenierung laufen kann in vitro nachgeahmt werden , wie folgt: villöse Zytotrophoblasten unter normoxischen Bedingungen (8% O 2) gehalten werden , bis sie in Synzytiotrophoblasten unterscheiden. Sie werden dann in hypoxischen Bedingungen (0,5% O 2) für 4 Stunden, gefolgt von einer weiteren 18 h Normoxie (Reoxygenierung) unterzogen. Mit dieser Hypoxie / Reoxygenierung Ansatz, Trophoblasten exhibit dereguliert Redoxzustand und erhöhte Spiegel von intrinsischen Apoptose 8, wie in bestimmten Komplikationen während der Schwangerschaft beobachtet. Daher ist dies ein in vitro – Modell nützliche neue präventive und therapeutische Ansätze zu bewerten Schwangerschaftskomplikationen mit plazentalem Hypoxie / Reoxygenierung verbunden zu bekämpfen.
Plazentalen Zellen produzieren Melatonin, das mehrere wichtige Funktionen, wie beispielsweise eine Fähigkeit , 15 oxidativem Stress und Plazentadysfunktion zu vermeiden. Hier präsentieren wir die experimentellen Ansatz und Zellmodelle verwendet , um die schützende Wirkung von Melatonin in der Plazenta Trophoblastzellen auf molekularer, zellulärer und funktionaler Ebene 8 zu demonstrieren.
Bei Säugetieren ist die Entwicklung des Fötus direkt abhängig von ausreichend Plazentafunktion. Die Entwicklungs Ursprünge von Gesundheitsstörungen werden auf der Hypothese aus , dass die Ursache von Krankheiten im späteren Leben manifestieren können zu frühe Entwicklung zurückverfolgt werden und dass die Plazenta hat eine mechanistische Rolle in der fötalen Programmierung 30-32. Die Plazenta ist der Schlüsselmediator der fetalen Wachstum und Entwicklung: es Nährstofftransfer regelt, schützt vor …
The authors have nothing to disclose.
Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Ministère de l’éducation, de l’Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Santé, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) and the Programme de bourses d’excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.
Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Splinter Forceps Fine 41/2in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Gauze Sponge 10cm X 10cm | Cardinal Health | 361020733 | |
Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8L) |
Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114MM DIAMeter) |
Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 Cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
250 Ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
50 Ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
15 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
50 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
10ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
Cell Strainer 100μm Nylon | Corning | 431752 | |
Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
500 Ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0,22 µm / medium and HBSS preparation | |
2 Ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1L of digestion solution |
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25mL (1M) for 1L of digestion solution |
Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888U |
Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000U |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100mM |
Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800mM |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36mL |
Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50mL |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
50 Mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
17 Mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
Anti-Vimentin ourified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |