Introduction
血管新生は、分極方向の特異性と移行、および血液供給を必要とする組織に新しい血管系を形成するために、内皮細胞（EC）を促進する細胞外シグナリングの合図によって誘発されます。血管新生を駆動するために考え要因は、細胞外マトリックス（ECM）からの信号です。物理的な合図に応答して、電気部品は、血管網1,2の形成方向移動を案内する方向特異性を有する新しいブランチを拡張します。 ECの形態および分岐のアーキテクチャは、アクトミオシン収縮3の調節に調整されている方法で、微小管（MT）細胞骨格の局所的な規制によって定義されます。形成するために、ECの枝ためには、ミオシンIIは、局所的にローカライズされた膜の突起部4で、その結果、ダウンレギュレートされなければなりません。同時に、細胞内の同じ場所に、MTの成長のダイナミクスは、分岐エロンを促進するために遅く、持続的なMTの成長で得られた修飾になりますゲーションと安定性5。このコーディネート細胞骨格の調節は電気部品が指向性の移行を容易にするために、それらの形態を分極することができます。
偏細胞形態の開発は、偏MTアセンブリ6が必要です。上皮細胞の移行では、MTが特に細胞7-9の先端でゆっくりと持続的に成長します。ニューロンにおいてながら、軸索や樹状突起の開始および伸長は、MTSがないだけで存在していることが必要ですが、彼 らは、動的に組み立ておよび分解10-15のプロセスを受けていること。このように、MTの成長ダイナミクスの局所的な制御は、細胞の構造を決定したECは、そのECMをナビゲートとして細胞形態の急速な改造を可能にします。
MT成長ダイナミクスは、分子モータータンパク質と非モータータンパク質の家族によって規制されている、微小管結合タンパク質または微小管相互作用タンパク質（以下REFEと呼ばれます）のMAPとRRED。 MAPは、ローカルに典型的には、細胞- ECMインタフェース16,17で開始シグナル伝達カスケードを介して、アクティブまたは不活性化することができます。 MTに結合し、MTの組立・分解の動態を変化させることによって、一度アクティブ、MAPの機能。これにより、局所的に細胞の形状や極性18-20を促進するために、MTのダイナミクスを調節するように機能します。有糸分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）はMTの終了やカップルMTの解体21-23へのATP加水分解に特異的に結合するキネシン13家族のMAPです。 MCAKのこの機能的役割は、紡錘体24-28内の重要なだけでなく、相間29,30の間にあることが知られています。間期のEC内では、MCAK媒介MTの分解はRac1の低分子量GTPaseの活性化を誘導し、エッジを創傷に応答して、MCAKのローカライズされたオーロラ誘導リン酸化によって調節されます。このシグナル伝達カスケードの結果はルに向かって偏MTの成長の結果、ECの立ち上がりでMCAKの阻害であります電気部品31の移行の後縁のエッジとMCAKに誘導されるMTの分解をading。
MTの成長動態を測定するための従来の方法は、典型的には、蛍光標識されたチューブリンまたは、より最近では、蛍光標識されたMTエンド結合タンパク質1または3（それぞれEB1またはEB3）のいずれかの手の追跡を使用しています。蛍光チューブリンアプローチは全体MT配列を標識するという利点を有します。有糸分裂細胞型の大部分は相間8,32,33中のMTの半径方向の配列を維持するためしかし、中心体周辺のMTは非常に緻密であり、その結果、蛍光チューブリンとMTの成長および分解を追跡することは、通常、周辺に限られていますセル領域。これらの制限のために、蛍光標識されたEBタンパク質（EB1またはEB3）の利用はMTのダイナミクスを測定するためのより一般的なアプローチとなっています。 EBをのみMTの成長に加えて、両端にラベルを付けているので、彼らは明るい蛍光が来て、（1-3μm）のような小さい表示されますTS、極めて限定されたバックグラウンド蛍光34-37でMT重合の容易に識別可能なマーカーを提供します。 MT配列のサブセットのみのEBラベルがEBアプローチの主要な強さを表しているという事実は、それはまた、1つの重要な制限を強調しているが、その非成長のMTは、EB3アプローチによって標識されていません。それにもかかわらず、測定し、時間をかけてEB3彗星を追跡し、サブセルラー領域内のMTの成長を視覚化する能力は、MTの組織の地域の評価を必要とするアプリケーションのために、このアプローチに最適です。
MTの成長動態を測定するための従来の方法のもう一つの重要な制限は、非常に大きなデータセットとデータ分析に必要な時間でした。この制限は、高時間分解能でのEBの彗星の数百の手の追跡のための必要性に由来します。また、これらの測定は、細胞の統計的に有意な数で行い、また、コントロールとexperimeの様々な環境下で実行される必要がありますNTAL条件。最近では、これらの制約は、生細胞35にタイムラプス顕微鏡を用いて具体的に追跡EB3彗星に向けコンピュータ解析技術によって克服されました。適切に使用される場合、この計算手法は、MTの重合を測定するハイスループット方法を提供することに加えて手追跡に関連付けられた人的ミスの可能性を制限するの両方に役立ちます。 MatLabのベースのソフトウェアパッケージ、plusTipTrackerを使用して、MTダイナミクスの計算分析、蛍光標識されたEB3彗星5,31,35,38を追跡することによって、MTの成長の測定を可能にします。また、plusTipTrackerソフトウェアが成長しているMTのトラック内EB3彗星の消失に基づいて、MTの破局イベント（ 別名解体）の計算を可能にし、興味のあるユーザ定義領域内のMT成長ダイナミクスのサブセルラー（ 別名地域）分析を可能にします。私たちの研究のために、MTの成長ダイナミクスは内比較しました非分岐の領域対、または細胞立ち下がりエッジに対するリードする内分岐鎖状の領域。 plusTipTrackerソフトウェアから出力されたデータは、個々の細胞および細胞下領域のカラーコード化されたトラックオーバーレイを生成するために使用することができます。
ここでは、MTの成長のダイナミクスと形態と方向性のある移動を分岐ECの規制にこのMT分解酵素の寄与を調節するのにMCAKの役割を調査するために使用する方法を説明します。我々のアプローチは、簡単に培養し、プラスミドcDNAの電気穿孔によって誘発される、一過性トランスフェクションに非常に適している初代ヒト細胞株、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、使用していました。私たちは、その後、高解像度を使用し、タンパク質3（EB3）と分裂セントロメア関連キネシン（MCAK）特異的cDNAのバインディングMTエンドでトランスフェクトしたHUVECのタイムラプス蛍光顕微鏡は、MTのダイナミクスへの影響はHUVECをトランスフェクト評価するために構築します。 EB3のPlusTipTrackerベースの計算画像解析MTプラス端はMT成長ダイナミクスの実験操作の効果を測定し、比較するために、タイムラプス画像でMTの成長速度とMT成長寿命を測定することであった標識。この方法論は、MTのダイナミクスの研究とサブセルラー領域内のMTダイナミクスの規制が分岐ECおよび移行の血管形成過程にどのように寄与するかを、ローカライズの同定を可能にします。これらの技術は、蛍光生細胞中で標識し、発現させることができる任意のMAPの調査に適用可能です。
Protocol
1. HUVEC文化とメンテナンス
- （詳細については、マテリアル/機器のリストを参照）フェノールレッドフリー内皮基礎培地を内皮細胞増殖培地サプリメントのパッケージと5％のペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質混合物の全体の内容を追加することにより、完全な内皮基礎培地を準備します。水浴中で37°Cまでのウォーム完全な内皮基礎培地。
- 液体窒素保存から1 HUVECのクライオバイアルを外し、2分間37℃の水浴中で急速に解凍。 〜80から90パーセントを解凍すると、クライオバイアルに温め完全な内皮基礎培地500μlを追加し、ピペッティングにより混和し、温め完全内皮基礎培地15 mlを含む100ミリメートルのプラスチック組織培養皿に細胞を均一に分配します。
- 5％CO 2で37℃のインキュベーターに入れる細胞。細胞は一晩接着させます。細胞培養培地を削除するか、変更しないでください。
- 100mMの皿は、> 90％コンフルエントのときに、HUVECをIを転送しますそして75cm 2の組織培養処理フラスコNTO常時60>での％コンフルエンスを維持する（ステップ1.5を参照してください）。
注：密度> 60％で維持した場合、HUVEC倍加時間が一貫して18から20時間です。- 細胞を継代する必要がない状況（ すなわち、密度が<90％である）のために、培地を吸引し、新鮮な完全内皮基礎培地で48時間ごとに交換してください。
- 時のHUVECリーチ> 90％のコンフルエンス、1×PBS 10mlで2回すすぎ、その後、それらを37℃で1〜2分間、0.25％トリプシン1.5mlを処理することにより、組織培養皿から細胞を除去します。注：HUVECの生存率を大幅にトリプシン曝露の長さを延長することによって低減されます。
- 4の割合でトリプシン/ HUVEC混合物に8.5ミリリットルの完全内皮基礎培地を加えることによってレスキュー細胞：1内皮基礎培地の完全な：トリプシン（最小限の比率）、および15ミリリットルコニカルチューブに集めます。
- 4分間の1400×gで遠心分離します。吸引物上清。
- 完全な内皮基礎培地2mlにペレットを再懸濁し、完全な内皮基礎培地25mlを含む新しい225センチメートル2組織培養フラスコに細胞を追加します。
前HUVEC文化2.カバースリップの準備
- フィブロネクチン基質でコーティングカバーガラス。
- 100％エタノール中で室温（RT）できしむクリーン22ミリメートル番号1.5カバースリップ39とストアを準備します。
- カバーガラスを火炎とピンセットを用いて、35mmのペトリ皿にそれを置くためにブンゼンバーナーを使用してください。
- PBSの990μlのフィブロネクチン株式の10μlの（1mg / ml）を混合することによって、フィブロネクチン/ PBS混合物を準備します。
- ピペット35mm皿でカバーガラス上にフィブロネクチン/ PBS混合物250μlの。カバーガラスの表面を覆うように均一に広げます。
- 37℃で3時間の最小値のための皿をインキュベートし、使用前に1×PBSの2ミリリットルで3回すすいでください。
- カバーガラスのアクティベーション
- 撹拌プレート上で10分間、50％3-aminopropyltrimethyloxysilaneに22ミリメートル番号1.5カバースリップを置きます。インキュベーション後、各2分間10回洗浄し、二重蒸留H 2 O（のddH 2 O）。
- 撹拌プレート上で30分間、0.5％グルタルアルデヒド中でカバースリップをインキュベートします。インキュベーションの後、のddH 2 Oで2分間、10回洗浄
- ポリアクリルアミドの準備
- 40％アクリルアミド3.75 mlの2％のビス-アクリルアミドを0.3mlとのddH 2 Oを0.95 mlで添加することにより0.7キロパスカル（kPaで）の遵守PAゲルを準備
- 過硫酸アンモニウム（APS）の10％ワーキング溶液を調製し、使用するまで氷上で保管。
- ddH 2 Oの0.83μlの、ビスアクリルアミド溶液を41.7μlを添加、1カバーガラス（総容量= 166.7マイクロリットル）のためのPA溶液を調製するには、10％のAPSの124μLを（ステップ2.2.2.1製）、およびTEMEDの0.25μlの。
- すぐに疎水性のスライドガラス上にPA液の15μLをピペット（試薬リストを参照してください）および活性化22ミリメートル番号1.5カバースリップでカバーしています。 PAは、RTで20分間重合させました。
- カバースリップを外し、35mmの皿に移します。 1×PBSの2ミリリットルで3回洗浄します。 4°Cで<2週間保管してください。
- ポリアクリルアミドゲルにフィブロネクチンをバインドするには、UV光の7500 J（254nmの）と2 mMのスルホ - SANPAHにポリアクリルアミドでコーティングされたカバースリップを公開します。 ddH 2 Oで一回すすぎ
- PBSの990μlのフィブロネクチン株式の10μlの（1mg / ml）を混合することによって、フィブロネクチン/ PBS混合物を準備します。
- ピペット35ミリメートルのペトリ皿中のカバースリップ（複数可）へのフィブロネクチン/ PBS混合物250μlの。カバーガラスの表面を覆うように均一に広げます。
- 37℃で3時間の最小値のための皿をインキュベートし、使用前に1×PBSの2ミリリットルで3回すすいでください。
- 完全な手順1.5から1.6まで。
- 血球計数器を使用して、細胞数をカウントし、100,000個の細胞（非遊走実験用）/カバースリップまたは500,000個の細胞（遊走実験用）/カバースリップを含むボリュームを収集します。 4分間の1400×gで遠心分離によって細胞をペレット。
注：移行プロトコルは、セクション9に記載され、以下に。 - 再懸濁細胞を、100μlのエレクトロポレーション緩衝液を用いてトランスフェクトします。 1μgのcDNAと結合し、エレクトロポレーションキュベットに入れます。エレクトロポレーション細胞：HUVECのエレクトロポレーション（：-034、例えばプログラム番号）に指定されたプログラムを用いてDNA混合物。
- レスキューは（上記、プロトコル2.1を参照）、フィブロネクチンでコーティングした22ミリメートル番号1.5カバースリップ上に500μlの完全な内皮基礎培地とプレートの細胞で細胞をトランスフェクトしました。 cDNA構築物の発現のための時間を可能にするために3-4時間、37℃でインキュベートします。
- 2.5センチメートルのx 0.65センチメートルのストリップに両面テープをカットします。
- 清浄なスライドガラスを得ます。両面テープの2つのストリップを取り、スライドの上部と下部の縁に沿って水平に固定します。注：ステップ4.5）に記載したように、チャンバをシールするためのテープとスライドエッジとの間の空間の少量を可能にするために重要です。
- テープ上のカバーガラスの残りの2辺となるよう、（セルサイドダウンステップ3.4から）マウントカバースリップ。カバースリップを確保するためにそっと押すように鉗子を使用してください。
- マイクロピペットを用いて、カバーガラスとスライドとの間イメージング媒体40μlの（25μMHEPESを補充した完全内皮基礎培地）を追加します。カバースリップとスライドの間に空間が完全に画像媒体で満たされていることを確認してください。吸引し過剰イメージング媒体（必要な場合）。
- 暖かいVALAP（：1：1ワセリン：ラノリン：パラフィン1）ですべてのエッジを封印。 gentlを押して漏れをチェックカバーガラス上のy。
- 予め温めた（37℃）顕微鏡ステージ上に搭載され、密封されたカバーガラスを配置します。
5.顕微鏡
- 60X、1.40開口数（NA）微分干渉コントラスト（DIC）油浸対物レンズ、自動焦点監視システム（PFS）、透過照明用の電子シャッターを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて、X-及び-Yは、モータリングステージ、電子フィルタホイール内に収容されたバンドパスフィルタ、およびモノリシックレーザコンバイナモジュールは、細胞/カバーガラスの界面で顕微鏡を集中し、1つのセルを配置するために顕微鏡ステージのジョイスティックを使用しています。
- 画像ソフトウェアプログラムの「カメラ設定」パネルをクリックします。カメラの設定パネルの「露光時間」ドロップダウンウィンドウ内では、400ミリ秒を選択します。
注：露光時間は変更になる場合があり、経験的に決定されるべきです。 - で「ND取得」パネルをクリックします。画像ソフトウェアプログラム。 ND取得パネルのラムダ（λ）タブ内では、488と561 nmのレーザーを選択するには、チェックボックスをクリックしてください。 ND取得パネルの「時間」タブ内には、2秒と2分の合計時間に取得時間を設定します。
- 両方の488と561 nmの照明のために400ミリ秒の露光時間を使用して、2秒の取得間隔で2分のタイムラプス画像シーケンスを取得するためにND取得パネル内の「今すぐ実行」ボタンをクリックします。
- 画像ソフトウェアプログラムの「光学構成」パネルで、ステップ5.2で説明したカメラの設定を使用して、405 nmのレーザーボタンをクリックし、青色蛍光タンパク質（BFP）の単一のイメージをキャプチャする」を取得」をクリックして、タンパク質を標識。
注：この波長は時間をかけて細胞を損傷することができますように、405 nmレーザー照射への細胞の曝露（画像キャプチャおよび/または露光時間の頻度）を制限することが一般的にお勧めします。- MCAK-shRNAの研究のために、BFP標識されたshRNAの発現を確認するために、単一の405 nmの画像をcquire。
- 画像ソフトウェアプログラムの「光学構成」パネルではと形態解析を分岐するための細胞の単一DICイメージをキャプチャするために、「取得」をクリックしDIC]ボタンをクリックすると、ステップ5.2で説明したカメラの設定を使用して（セクション10を参照してください、下記）。
- 画像取得に続いて、デジタル的に画像信号を増加させるために画像ソフトウェアプログラムで「明るさ/コントラスト」機能を使用します。
- 明るさとコントラスト調整画像をエクスポートします。クリックして「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」後、画像ファイルタイプの「.TIF」を選択する]をクリックします。
注：ステップ5.4で説明したように撮影したときにこれは通常、単一の2分のタイムラプス取得から61の.tifイメージファイルを生成します。
6. MT動力学解析
- EB3追跡のために、plusTipTrackerソフトウェア35を使用し 、オープンソース、自動検出、追跡、分析、および蛍光標識したEBの可視化のために設計されたMatLabのベースの計算ソフトウェアパッケージ。
- plusTipGetTracksグラフィカルユーザインタフェース（GUI）
- plusTipGetTracks GUI、型plusTipGetTracksにアクセスします。
- EB3彗星検出のために、.tifファイル画像を含む親ディレクトリを参照して選択するには、GUIを使用しています。
- plusTipGetTracks GUIのトラッキングパラメータパネル内で、次の値を入力します。検索範囲半径= 5から10に。最小サブトラック長= 3;最大ギャップ長（フレーム）= 12;最大収縮係数= 1.0;最大角度フォワード= 25;最大角度下位= 10。変動半径（ピクセル）= 2;フレームレート（秒）= 2;ピクセルサイズ（ミクロン）= 110。
注意：まずtifファイル、画像ファイルの代表的なセットにplusTipParamSweepGUIを使用して、最適なトラッキングパラメータを確認してください。画素サイズに入力した値は、タイムラプス画像を取得するために使用される対物レンズに固有のものですS（上記、ステップ5.1から5.2を参照してください）。 - 関心領域（ROI）の選択のために、手動でポリゴンを形成する細胞のDIC画像を用いて、セル端を追跡することによって、全細胞のバイナリマスクを作成します。
- 関心のサブ領域（サブROI）選択のために、手動で変更plusTipTrackerサブROI選択ツールを使用して、関心の創傷縁セルを横切って2ポイント太い線を引くことで、先頭と末尾のエッジマスクを作成します。
注：行は、目的のセルが隣接創傷エッジ・セル31を越えて延びている位置での創傷端に平行に描かれるべきです。
- plusTipSeeTracksのGUI
- 確認して、視覚的にトラックオーバーレイの欄のボタンを "プロットは、トラック」をクリックするだけで「ROI」フォルダに保存されているの.tifイメージのトラックオーバーレイを検査します。すべてのトラックのオーバーレイのために繰り返します。
- オプション設定欄に「作成グループ」ボタンをクリックすることで、データのグループ化を実行します。 experimを選択データファイルをクリックすることで、同じデータセットに属している内部のデータ。 「グループ」簡単に（例えば、「対照群」）に識別できる名前を与えることによって、選択を保存します。
- サブROI MT成長ダイナミクス測定のために、画像の最小数は1 EB3彗星のトラックが「トラック」としての資格と、先頭と末尾のエッジのROI内のMT成長遠足を抽出するためにサブROI内で検出されなければならないことをフレーム入力してくださいGUIの「サブのROI」パネル内の「手動選択」をクリックして。
注：たとえば、として抽出する最小検出長として3フレーム（6秒）を使用し、「トラック」。サブのROIから抽出されたトラックは、各セルの元のROIフォルダ内のサブプロジェクトフォルダ内に保存されます。 - MTの成長サブトラックと部分集団解析
- 平均MTの成長速度を計算し、「グループ」のデータセット（ステップ6.3.2を参照）MT成長寿命を意味し、各ROIのための（STEを参照してくださいP 6.2.4）、および各サブROI（ステップ6.2.5を参照）。
- plusTipSeeTracks GUIのクアドラント散布図の列の中で、「グループの選択」をクリックして比較する（ステップ6.3.2で作成した）グループをクリックしてください。
- x軸オプションの「成長スピード」を選択し、ボックスに（ステップ6.3.4から）成長速度の平均値を入力します。 y軸オプションの「成長寿命」を選択し、ボックスに（ステップ6.3.4から）成長寿命の平均値を入力します。
- 「開始/終了時にトラックを削除」し、次へ]の横のボックスをチェック「グループでのバッチプロセスを。」 MT成長セル全体のためのトラック、前縁の配布プロファイルを生成するために、「プロットを作成する」をクリックし、立ち下がりエッジサブのROI。
注：ここで説明する研究のために、MTの成長トラックは4亜集団に配布されますが遅いと短命、遅いと長寿命、高速かつ短命、迅速かつ長寿命。 - クリックして「データ」[データのドロップダウンウィンドウから「データ分析」をクリックしてください。 「t検定を：等分散を仮定して、2つのサンプルは、「選択MTの成長速度とMT成長寿命を意味比較すること。 t検定比較はp値<0.001になり、スプレッドシート内のデータセルを強調表示します。
7.共局在解析
- イメージングソフトウェアプログラムの「ラインツール」を使用してバックグラウンド減算については、グリーンチャンネル画像（488 nm励起）に10μmの2である正方形の形状を作成するために、画面上でクリックすることにより、関心領域（ROI）を描くに何の細胞蛍光（バックグラウンド）が存在しない位置。ステップ5.8からの画像を使用して、赤チャンネルの画像（561 nm励起）のためにこれを繰り返します。
- イメージングソフトウェアの広報を使用して、ogram、右のステップ7.1からROIをクリックして選択し、「背景ROIとして設定します。」をクリックして「画像」全体から（ステップ7.1から）の平均バックグラウンド値を減算するドロップダウンウィンドウから「減算背景」をクリックしてください画像。エム・オーロラAのいずれかmCherryを-MCAK、マップル-EB3、またはマップルチューブリンを共発現する細胞のためのバックグラウンド減算を実行します。
- バックグラウンド減算赤チャンネルの画像でのみ、バイナリリボンをクリックして、「しきい値の定義」を選択し、指定された蛍光マーカーを排除する「チャネルあたり」機能を選択します。
注意：しきい値のステップは、具体的に共局在解析（ステップ7.4を参照）のための閾値化オブジェクトをマークされた行を描画できるようにmCherryを-MCAK、マップル-EB3、またはマップルチューブリンイメージのいずれかで実施しました。 - イメージングソフトウェアでラインツールを使用して、閾値処理画像内の除外オブジェクトの上に2点太い線を引きます。
- ステップ7.4で引かれた線オブジェクトを選択します。コピーして、それに対応する緑のチャンネル（エム・オーロラA）画像上に赤チャンネルからのラインオブジェクトを貼り付けます。
- ラインがイメージングソフトウェアプログラム内のドロップダウンウィンドウから「メジャー」、次に「強度プロファイル」を選択することによって、個々のセルのための共局在および総エム・オーロラAの値を計算するために、オブジェクトの下にグレースケール画素強度値を測定します。
- 表計算ソフトにエクスポートし、型.XLSとしてファイルを保存することによって実験的治療とサブセルラー地域（例えば、「control_grayscale_intensity.xls」）によってデータを整理します。
注：この方法で示されたデータは、サブセルラー地域あたりの総実測エム・オーロラAの共局在の割合を表します。
- 表計算ソフトにエクスポートし、型.XLSとしてファイルを保存することによって実験的治療とサブセルラー地域（例えば、「control_grayscale_intensity.xls」）によってデータを整理します。
- ステップ7.6、繰り返しステップ6.3.7からの測定値を使用して有意性のカットオフように、p <0.05を用いて統計的有意性を計算します。
- パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドの同時抽出/固定バッファ（PGF-PHEMで細胞（ステップ3.4参照）を修正しました; 4％パラホルムアルデヒド、0.15％グルタルアルデヒド、60mMのパイプ、27.3 mMのHEPES、10mMのEGTA、および8.2 mMの硫酸マグネシウムで0.2％の洗剤4、RTで10分間、pH7.0）で。
- 1×PBSの2ミリリットルで5分間、3回すすいでください。
- 反応性アルデヒドをクエンチするために0.01グラム/ミリリットルのNaBH 4での1×PBSで15分間、2回を扱います。
注意：カバースリップを浮遊させることができるのNaBH 4フォームの泡を。カバースリップはこれらのインキュベーション中に沈めたままにすることが重要です。カバースリップがフロートし始めた場合、気泡が脱出することを可能にするためにカバースリップの一端を高めるために鉗子を使用しています。 - RTで1時間ロッキングプラットフォーム上で1×PBS中の5％無脂肪乳でブロッキングする前に、1×PBSで2回洗浄します。
- およびラット抗αチューブリン（：一次抗体（千）ウサギ抗pT288-オーロラA（1）で細胞をインキュベート500）1×PBS溶液中で調製：1。ロッキングプラットフォームの一晩に4℃でインキュベートします。
- 2時間5％の無脂肪牛乳で製造した二次抗体と共にインキュベートする前に、1×PBS中で5分間、3回の一次抗体を除去し、すすぎ（千）ロバ抗ウサギ（1：1,000）およびヤギ抗ラット（1） 37℃。
- 蛍光最適化された封入剤でスライドガラス上にマウントカバースリップ。明確なマニキュアを使用してスライドにカバースリップの端をシールし、そして4℃で暗所で保存してください。
9.細胞遊走アッセイ
- 上記のように移動アッセイのために、HUVECの培養を行う（プロトコル3：カバースリップ上でcDNAをトランスフェクションおよびHUVEC文化、3.2から3.3のステップ）。
- 細胞トランスフェクション、80μlの完全な内皮基礎培地と救助トランスフェクトした細胞を次に示します。乾燥したフィブロネクチンでコーティングした22-mmの丸号1.5カバースリップの中央に一滴として80μlのサンプルをピペット。 80μlのDROを広げないでください。P。コンフルエント単層に細胞接着のための時間を可能にするために3-4時間、37℃でインキュベートします。
注意：カバースリップを乾燥はカバーガラスの接触の際に広がるから80μlの低下を防止する必要があります。このアプローチは、HUVECををカバースリップの小さな領域に集中することを可能にし、それによって細胞のコンフルエントな単層の急速な形成を促進します。 - 非付着細胞を除去するために、完全な内皮基礎培地で2回洗浄します。
- 「傷の端、「静かに（ステップ9.2から）HUVEC単層全体にきれいなカミソリの刃をドラッグすることにより滅菌カミソリの刃でカバースリップをこすりを作成します。掻き中にカミソリの刃の滑りを防止するために鉗子で所定の位置にそっとカバーグラスを保持します。
- 細胞は3時間37℃のインキュベーターで回復することを可能にします。アセンブルおよびイメージングのためのカバースリップ（S）をマウント（プロトコル4を参照）。
- 使用して、顕微鏡で12時間、10分間隔で位相コントラストおよび488nmの画像を取得10×0.45 NA相対物レンズと、画像取得ソフトウェアプログラムの「ND取得」パネルを使用して0.52 NA LWDコンデンサー（ステップ5.3参照）。
HUVEC分岐および移行の10定量
- 分岐解析のために、さらには細胞照明と公正な定量化を可能にするために、トランスフェクトされたHUVECの顕微鏡画像を取得する（ステップ3.3を参照）、マップル-C1 cDNAは、細胞容積マーカーを発現構築。
- イメージングソフトウェア・プログラムを使用して、マップル-C1の画像を開いて、膜が湾曲の最大角度を表示枝の両側に位置するラベル。直線で、これらの2つの点を接続します。この行は、「分岐元」です。
- イメージングソフトウェアのラインツールを使用して、視覚的にステップ10.2で決定された「分岐元」から長さが>10μmで測定枝を識別します。目からの距離を測定することによって、分岐の長さを計算します枝の先端の最遠位点に電子「分岐元」（ 図4参照）。
- 取得するために、長さ> 10μmの測定分岐鎖状の突起数カウント「セル枝番を。」
- 実験が含まれる場合、移行の分析のために、ステップ9.6において収集された画像を使用して、視覚的に物理的な場所に基づいて（創傷の縁に物理的に、すなわち細胞）と発現プロファイルを創傷エッジHUVECを識別する（ すなわち 、緑色創傷縁セルを選択GFPの発現）。
- 細胞の位相コントラスト画像を用いて、視覚的に核（セルの中心に近い半透明の球状構造）を識別し、次に視覚的に核小体（核内小、暗色、球状構造）を識別タイムラプス画像の最初の時点。核小体のx、y座標を標識するために核小体の位置をクリックします。
- イメージングソフトウェアを使用して、手で追跡タイムラプスムービー（ 図4）の各フレームに核小体のx、y座標を標識する核小体の位置をクリックして、連続するタイムラプス画像で核小体。
- イメージングソフトウェアを使用すると、「ファイル」をクリックして、その後の.xls」後、画像ファイルの種類を選択する]をクリックし、「名前を付けて保存をクリックしてください。」
- 表計算ソフトを使用して（ステップ10.8から）手追跡データファイルを開きます。平均移動速度を計算し、原点に移動距離を意味します。
- 表計算ソフトウェアプログラムを使用して、[データのドロップダウンウィンドウから「データ分析」をクリックして「データ」をクリックしてください。統計的有意性のカットオフとして> 95％の信頼度で分散検定のボンフェローニ補正され、一方向の分析を選択します。
Representative Results
生細胞の顕微鏡用HUVEC培養
蛍光タンパク質を発現するHUVECの生細胞のイメージングは、HUVECを、通常の細胞増殖および維持、ならびに正常なタンパク質の発現および機能のために適切な環境で維持されることを必要とする。 図1は、プロトコルの概略図がバッファを調製するために使用示します密閉系生細胞のタイムラプス画像を収集するための光学特性を最適化し維持します。両面テープの薄いストリップは、ガラススライド（ 図1A）上に配置され、次いで培養たHUVECを含有するカバースリップは、細胞はスライド（ 図1B）に対向するようにテープの上に反転されます。この方法では、テープは、二枚のガラス表面間の小さな隙間を提供し、（ 図1C;上記プロトコル4を参照）の細胞は、適切な細胞培養培地に浸されることができる空間を作り出します。私クローズドシステムを確立するために、（ 図1D 1混合物、VALAP 1：1）：ラノリン：パラフィンワックスNAの最終ステップは、カバーガラスは、ワセリンを使用してスライドガラスにシールされます。この細胞培養法は、より短い時系列EB3彗星のイメージング長い分岐時系列と移行実験のための両方のために使用しました。さらに、VALAPのワックス様稠度は、固定および免疫標識を含む補足的なアプローチは、（プロトコル8を参照）、同じカバースリップおよび細胞サンプルに対して行うことができるような画像化実験の終わりにスライドガラスとカバーガラスから容易に除去することができますそれは、生細胞イメージング法を用いて可視化しました。
図1：生細胞顕微鏡イメージングのためのHUVEC文化の方法論 （A）が 0.65センチメートル×2に両面テープの2枚をカット。50センチメートルの長方形のストリップとスライドの下縁に沿って、水平にスライドの上端、および他のピースに沿って両面テープの一枚を確保。 （D）に記載したように、チャンバをシールするためのテープとスライドエッジとの間の空間の少量を可能にするために重要です。 （B）のHUVECを含むカバースリップを削除し、テープ片の上にカバースリップ（セル側を下に）反転鉗子を使用して。 （C）マイクロピペットを用いて、カバーガラスとスライドガラスの間に撮影媒体（25μMHEPESを補充した完全内皮基礎培地）の40μlを添加します。カバースリップとスライドの間に空間が完全に画像形成媒体で満たされていることを確認し、気泡を避けます。必要に応じて、余分なメディアを削除するには、カバーガラスの縁に沿って吸引器を使用してください。カバーガラスのエッジの周りをシールする（パラフィン：1：1ワセリン：ラノリン1）（D）は、温かいVALAPを使用してください。撮影媒体漏れをチェックカバースリップ上にそっと周り押してsです。改善するために追加のVALAPを使用してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蛍光標識されたEB3の自動追跡は、細胞全体および地域のMTの成長ダイナミクスの総合的な分析を可能にします。 EB3タンパク質の、明確な明確な、そして非常に時間と空間分解顕微鏡像のコレクションは、細胞内EB3運動の解析に不可欠です。蛍光標識されたEB3のHUVECの発現は、典型的には、時間の期間にわたって同じセル内で増加した細胞からの細胞および蛍光強度に大きく異なります。これにより、MTの成長動態の増加EB発現の潜在的効果を同定するために、発現プロフィールにおけるこれらの変化を考慮し、監視することが重要です。これは、最高のグレースケール蛍光を評価することによって達成されるintensityはそれぞれ撮像された細胞のプロファイル、その後階調発現プロファイルの定義された範囲が表示され、それらのセルにデータ分析を制限します。発現プロファイルデータセットの最初の評価は重要であり、各セルに対してplusTipTrackerソフトウェアによって得られたMT成長動態データと比較されるべきです。発現プロファイルは、階調表現の所望の範囲を決定し、潜在的な外れ値を識別するために、実験群内の各セルのためのMTの成長速度とMT成長寿命に対してプロットすることができます。
図2のハイライトHUVECは、（上記のプロトコル2.1を参照）フィブロネクチン基板上に培養し、マップル標識EB3の最適なレベルの近くに発現しています。蛍光EB3彗星は12秒（ 図2A）の期間にわたって画像のタイムラプスシリーズに示されています。 plusTipTrackerソフトウェアを使用してEB3彗星の分析は、自動化され、フレームごとEB3彗星のDETEを伴いますction（緑と黄色の点、 図2B）。各フレーム内で検出された彗星は、その後、EB3トラックと視覚EB3トラックオーバーレイ（ 図2C-F）を生成するために、フレーム間の位置での変化に依存して、リンクされています。トラックオーバーレイは色分けされており、色の区別は、ユーザによって入力されたパラメータによって決定することができます。一般的に、これらの区別は、MTの成長速度とMT成長寿命5,31の地球の平均を使用することにより、4つのグループにデータを分割：遅いと短命（赤）、遅いと長寿命（黄色）、高速かつ短期（緑）に住んでいた、迅速かつ長寿命のMT成長（青; 図2G）。 EB3標識MT成長ダイナミクスのPlusTipTracker媒介追跡も利息（ROIを）のユーザー定義領域を可能にします。 PlusTipTrackerによりMT成長DYNAMの比較を可能にする、ユーザ定義のROI（ 図2A、BおよびF）の中からMTの成長軌道データを抽出します同じセルの異なる領域内のICS。
図2：EB3 彗星検出、追跡、およびplusTipTrackerデータ出力マップルEB3を表すHUVECの（A）タイムラプスムービー。左側のパネルには、セルの境界のマーキングを解除する全細胞ビューおよび全細胞マスク（白線）を示しています。レッドボックスはタイムラプス画像（右パネル）に示したズーム領域を示します。右パネルは、連続撮影のフレーム（ - トン= 12秒トン= 0秒）でEB3彗星の生のグレースケールのタイムラプス画像を示します。 （B）（A）に示す画像からEB3彗星のplusTipTracker検出。左のパネルは、検出された彗星（黄色のドット）の全細胞図を示しています。レッドボックスはタイムラプス画像（右パネル）に示したズーム領域を示します。右パネルは、5つの検出EB3彗星（赤い矢印）をハイライト表示し、12秒の撮像期間にわたりこれらの5彗星を追跡します。緑ドットは存在しなかった（または検出されなかった）前の時間間隔で検出されたEB3彗星を表します。 （C）（A）に示すEB3彗星の61フレーム（2分の映画）の最大値投影。 （D）（C）に示したのと同じ61フレーム（2分の映画）のplusTipTracker MTトラックオーバーレイ。最大値投影（Cの赤いボックス）の（E）ズーム。最大値投影のplusTipTracker MTトラックオーバーレイの（F）ズーム（D中の赤いボックス）。 （D）及び（F）に示すトラックオーバーレイ用（G）色分けされた伝説。 、遅い速い、短命や長命のような指定は、10マップル-EB3を発現HUVECのグループで測定されたすべての成長トラックの平均値に基づいています。簡単に視覚化するために、（D）及び（F）のトラックオーバーレイは（A）に示したセル画像の反転画素強度を用いて生成されます。スケールバー=20μmです。/files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HUVEC分岐と移行パターンは、ECMからのメカノ物理信号に敏感です。
HUVECを十分に特定のシグナリング・キュー（複数可）36,40-42に適切な細胞応答を決定する形態学的変化を受けるように、そうすることで、シグナル伝達手がかりの様々なタイプに対応し、することが知られています。フィブロネクチンコーティングされたガラス基板（ 図3A）に、または硬い2次元ポリアクリルアミドのECM上で培養したHUVEC（55キロパスカル）は、典型的には、いくつかの明確な分岐鎖状の突起（ 図3B）の円形または細長い形態を表示します。しかし、非常にソフトな2次元ポリアクリルアミドのECM（0.7キロパスカル）に培養された場合、HUVECを遵守誘発性ダウンに起因することが知られている高度に分岐した形態を表示しますミオシンII収縮4,5,31（ 図3C）の規制。このように、HUVECをECMのmechanosensingを通じて細胞形態を調節し、これはMTダイナミクスのローカライズされた変調およびアクトミオシン収縮によって達成されます。
HUVECを分岐HUVECを測定するために、形態学的属性の広範囲を表示するので、第1枝突起が何であるかを定義するために、その後分枝状突起を客観的に測定する方法を定義することが重要です。一つの技術は、セル境界または「マスク」は、セルのエッジ（ 図 3D）を定義するために、蛍光量マーカーを発現する細胞の画像を用いてセルのエッジをトレースする手によって生成される4つのステップのアプローチを使用します。マスク生成に続いて、分岐起点は分枝突起と細胞体の間の曲率の最大角度を配置することによって定義されます。ラインはデマに描かれていますRK「分岐元」（紫色の角度の付いた線と、 図3E）。分岐数は、定義された分岐元（ 図3F）と分岐の数を計数することによって簡単に測定されます。支店長は、遠位分岐先端（ 図3G）への分岐原点からの距離として測定されます。データ分析から小さなラメリポディア突起の混入を避けるために、追加の基準は、彼らが（「分岐元」で）幅よりも枝が（「支店長」）より長くなければならないことを必要とし、枝は長さ5で少なくとも10ミクロンでなければならないこと、31。
図3： 形態を分岐HUVECの解析 （A - C）HUVECのDIC画像の例は、フィブロネクチンコーティングされたガラスのECM上で培養（A）硬い（55キロパスカル）、ポリアクリルアミドのECM（B）とソフト（0.7。kPaの）ポリアクリルアミドのECM（C）。堅いのECM（A、B）と比較して劇的に0.7 kPaのポリアクリルアミドのECM（C）上で培養したHUVECにおいて増加する分岐。 （D）。マップル-C1 cDNAを発現するトランスフェクトされたHUVECのDIC顕微鏡画像（左画像）（細胞容積マーカー;右の画像）を構築。 （E）曲率の最大角度（膜が最大の曲率を表示する、すなわち位置、紫色の線）を配置することにより、分岐元を定義し、分岐のいずれかの側にしてから（青線）直線で角度を接続します。 （F）を特定し、（Eで定義）「分岐元"から> 10μmのを拡張分枝状の突起を選択します。取得する分岐鎖状の突起数をカウントする「枝番を。」 （G）はカ月に「分岐元」の中心からの距離を測定します枝のST遠位点得ることがNISの要素ソフトウェアの注釈および測定アプリケーションでラインツールを使用して、「枝の長さを。」スケールバー=20μmとは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
センシングECMの遵守に加えて、HUVECをも感知し、スクラッチ創傷により誘導されるように、隣接するセルラー接点の排除に対応しています。遊走アッセイでは、単層で培養したHUVECは、（上述のプロトコル9を参照）の特性を測定するスクラッチ傷や遊走に供されます。単層を引っ掻くことにより、創傷の誘導後、創傷縁HUVECを傷（ 図4A、T = 0時間）内に延びる突出先端を開発することによって、分極します。 10-12時間の時間経過にわたって、偏創傷エッジHUVECを創傷領域に移行して埋めます新しいコンフルエント単層（ 図4A、トン= 11時間）を確立傷、。 HUVECは分岐の場合と同様に、現在の証拠は、分極と移行がMTとアクチン細胞骨格43-49の協調再編成に決定的に依存していることを示唆しています。これはなく、創傷縁のHUVEC 31の後縁で、先端のMCAKに誘導されるMTの解体のローカライズされた阻害を介して、部分的に達成されます。 MT力学の感度は、創傷誘導性のためにオーロラリン酸化し、リーディングエッジでMCAKの阻害キナーゼおよびMAPの阻害または活性化することができる他のキナーゼを含む多数の下流調節タンパク質を標的のRac1 GTPアーゼによって開始され、偏光局所的にMTの増殖を調節し、18,31,36,48,50-53を収縮。大規模な実験的証拠は、エッジ突起を先頭と末尾のエッジ収縮の調整がRac1の活性化のサイクルを支配されているという概念をサポートしていますそれによって導か運動9,41,51,52,54-58を駆動する 、立ち下がりエッジでアクトミオシンの収縮への立ち上がりでMTアセンブリおよびRhoAの活性化を促進します。
今日まで、細胞移動の自動追跡を実行するための確立された方法論は存在しません。これは、計算上の傷・エッジ・セルは分極と移行するよう一貫して変化している細胞ECMの境界を分析することの困難の結果です。多くのソフトウェアプログラムは、蛍光標識された細胞を59-64を追跡することが可能であるが、創傷縁の移行実験で蛍光標識されたHUVECの集団は、全HUVECの人口の約30〜40％であるので、創傷縁細胞の大部分がなければなりません位相差またはDICイメージングによって可視化すること。特定を識別するために、同じ創傷内に、蛍光及び非蛍光細胞を評価するための創傷のエッジの移行を測定する場合に加えて、それが重要です発現の効果は、実験研究グループ内および実験研究グループ間の両方で構成します。現在、HUVECの遊走を測定するための最良の方法は、創傷縁のセルが最初に識別され、その後、核および核小体が（ 図4B）が同定された手の追跡手法を使用することです。核小体は、その高い光散乱密度と比較的小さいサイズに細胞追跡するための位置決定基として使用されます。核小体のこれら2つの機能は、簡単に識別し、ユーザが個々のトラック位置を配置することができる領域を制限することにより、測定誤差を低減することを可能にします。 HUVEC移動トラックはその後、連続したタイムラプス画像フレーム内の核小体をクリックすることで生成されます。最後に、原点に移動速度及び移動距離を測定し、対照および実験細胞群（ 図 4B）について分析します。
図4： 創傷エッジのHUVECおよび移行追跡の分析スクラッチ傷エッジのHUVEC（ 別名 「移行アッセイ」）の11時間のタイムラプスイメージングシリーズの（A）20X位相コントラスト像。マイグレーションの傷及び方向は、パネル、T = 0時間で示しています。 HUVECを、細胞の単層は、（ - T = 11時間、T = 3.5時間）が形成されるまで、創傷に創傷エッジ事前に交差するように示されています。 （B）遊走アッセイタイムラプスイメージングの分析（Aに示すように）セルの位置（物理的に、創傷の縁部で、すなわち細胞）および発現プロフィールに基づいて、第一の追跡可能な創傷エッジHUVECの識別を必要とする（私は.E。実験は、GFPの発現を含む場合、）緑の創傷端のセルを選択します。位相コントラスト画像を用いて、核および核小体を識別する。手ANを使用して、連続したタイムラプス画像内の核小体を追跡しますNISの要素ソフトウェアで表記し、測定アプリケーションは、原点への移行速度と距離を決定します。スケールバー= 100μmの（A）、20ミクロン（B）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
形態と移行実験でのHUVECを使用します。
HUVECを内EB3標識MT成長ダイナミクスの生細胞のイメージングは、それらが次にECMシグナリングキューに割り当てることができるように、MTの成長及びHUVECの形態の変化を測定し、評価するために適切で再現可能な細胞培養条件を必要とします。 HUVECを、細胞の形状と運動性を研究するための優れたモデルを表します。彼らは両方の可溶性および物理的なシグナリングの合図に応答して劇的な形態を呈し、蛍光標識cDNAでのトランスフェクションに非常に適している、と彼らは、適切な細胞培養条件65-70を提供する際、血管管の中に自分自身を整理する能力を維持します。などのHUVECのような初代細胞培養物は、細胞が健康であることを保証するために、彼らは実験中に正常に動作することを慎重な取り扱いと細胞継代数の監視を必要とします。例えば、cytoskeleを調べる実験を行いますHUVECをは一般的に15に通路12の周囲に不均一な形態を表示するために始めるとトンおよび/または細胞形態は、HUVECを、第十細胞培養継代を超えた実験のために使用すべきではありません。
細胞密度はまた、HUVECの健康と増殖の重要な調節因子です。調査を分岐HUVEC（上記プロトコル10.1から10.4を参照）は、ECMと相互作用して、分枝状突起を拡張するために、細胞を物理的空間を提供するために、比較的低い細胞密度培養物を使用します。これとは対照的に、（プロトコルの10.5から10.8を参照）創傷縁の移行研究において、HUVECを前に創傷に、単層培養されています。このように、創傷縁HUVECを、比較的非分岐形態を示し、先端の突起を拡張し、それらが創傷に遊走するようにそれらのすぐ隣との細胞間相互作用を示します。
リビングのHUVECにおけるトラッキングMTダイナミクスの注意事項とメリット。
ディスク顕微鏡を回転することに優れたアプローチであります高時間分解能での共焦点画像の鮮明さを必要とする実験的な仮説をテストします。適切なカメラとレーザモジュールと、この顕微鏡法は、低放射蛍光に敏感であり、蛍光顕微鏡の他のタイプと比較して低減退色するのを助けることができます。異なる種々の細胞型において、EB3標識アプローチを使用して、MTの増殖動態の包括的測定値を生成するために必要とされる重要なことに、このアプローチは、高時間分解能イメージング中程度によく適しています。
標識成長MTプラス端のEB3方法は、蛍光標識MTの他の方法に比べて顕著な利点を有するが、それはまた、固有の欠点を有します。例えば、積極的に分解MTの集団と安定、非ダイナミックのMT 71-74の集団の両方を含む、任意の時点で成長していないMT配列の割合があります。 EB3は、MTのこれら2つの集団にラベルを付けないであろうとしたがって、これら2つの集団の貢献は、実験データの分析には含まれません。全体MTのアレイを評価するための代替方法は、MTの全ての集団に組み込まれており、成長縮小、および安定MTの識別を可能にする、蛍光標識チューブリンの発現に焦点を当てています。しかし、全体MT配列を標識微小管組織化中心（MTOC）にセルの中心と隣接する周辺MTアレイの比較的高い密度の細胞の近くにはないMTの端部の画像解析を行う際に不都合を作成周辺75-77。生細胞内の蛍光チューブリンと蛍光EB3とMTの2色同時標識を用いた実験は、チューブリン標識MTの大半はまたEB3標識78であることを、定性的に明らかにしました。さらに、蛍光チューブリンで標識されたMTの自動追跡の効率的な方法がなかったです。これは、そのデータcollec手段蛍光チューブリンを発現する細胞におけるションとMTダイナミクスの測定は、個々のMTの手の追跡、エラーが発生しやすいと面倒なプロセスを必要とします。その結果、EB3標識MTの自動化コンピューター分析は、それが多くの細胞タイプで、実験計画35,79の種々内MT動態実験に適用することができるように、MT動態を測定するための好ましい方法となっています。
HUVEC形態および移行にMT成長ダイナミクスのリンク。
細胞骨格の研究者の観点から、plusTipTracker自動追跡分析の1極めて有用な適応は、全細胞およびMTの成長ダイナミクスの地域変化の両方を測定し、評価する能力です。偏光になるため、細胞のための要件は、指向性細胞遊走に不可欠な前提条件です。このように、偏光シグナルキューが長い方向の細胞遊走のための重要な駆動因子として知られている30,31,51,54,56,80,81 2,82-87におけるVEGFキューに向かってMTの成長を誘導します。さらに、（例えば、コンプライアンス及び次元mechanosensing用）ECMとの物理的相互作用に応答して、HUVECを局所的にMAPが分岐状突起を伸長内のMTの成長を促進するために調節することにより、それらのMT動態を調節し、これは方向にHUVECの移動を案内しますキュー5,31,88。したがって、細胞外シグナル伝達の合図に応答して、分極が細胞骨格の動態の局所的変化の実験的評価の必要性を強調しています。
（EB3アプローチを使用して）MT成長動態およびHUVEC細胞の遊走の同時生細胞画像化は、MTSは、秒の時間スケール上に成長するので、細胞の形態及び方向移動の変化が時間の時間スケールで発生しながら、行うことが非常に困難です。しかし、両方のプロセスが密接リンケですD。また、第2タイムスケール上で蛍光標識EB3の連続的な、迅速な画像化はEB3信号の光退色をもたらします。 EB3（1〜2分取得シリーズ）30分ごとに成功しているの短いイメージングシリーズを行うことにより、この問題を克服しようとする試みが、唯一EB3の最適な発現を持っていたECの少数で達成することができ、それが有害表示されませんでした繰り返しレーザー照射5への影響。
MT成長ダイナミクスは、細胞の形態と遊走の変化に寄与するかの解釈を可能にする別のアプローチは、関心のplusTipTracker領域（ROI）ツール35（プロトコル6.6を参照）です。全細胞MT成長がMT成長トラックは次いで、抽出し、分析することが可能なユーザ定義の領域に副分割するトラックのこの方法は可能にします。例えば、セルの「非分岐」領域に対する「分岐」の比較は、MTSがより多くのを成長させることを明らかにしました低いより永続的分岐した領域内の非分岐状細胞外周5と比較して。偏創傷縁のHUVECでは、前縁及び後縁のMT成長ダイナミクスの比較はMCAKに誘導されるMTの解体後縁を前縁内で特異的に阻害するが、されていないことを明らかにしました。先頭およびRac1の、および/またはMCAKのリン酸化変異体を発現たHUVECにおけるエッジMT成長ダイナミクスを末尾の地域内の評価はさらに、オーロラキナーゼのRac1の誘導活性化を具体的かつ局所的にHUVECの偏光と方向性のある移動を駆動するために、前縁内MCAKの活性を阻害することが明らかとなりました31。このように、MTの成長のダイナミクスと分枝状突起および/または創傷縁HUVECの前縁内のMT成長ダイナミクスの地域評価の自動追跡の組み合わせは、私たちはHUVECの形態および移行にMTの成長のダイナミクスをリンクすることができました。
記載されているプロトコルは、デザイン性ありdはHUVECの文化や実験的調査のため、一般的に簡単で、再現性の高い方法を提供します。それにもかかわらず、プロトコルの詳細の多くは、今度は、実験的な方法論を実施するのエラーや困難のための機会を提供し、複雑で時間がかかります。それは、プロトコルを通じて潜在的な問題に対処しようとしたが、ここではあまり一般的ではないか、そうでなければ方法論のプロトコル内のノートと略記されている潜在的な問題の追加、詳細なトラブルシューティングが提供されます。
ポリアクリルアミド基板（プロトコル2.2）で被覆カバーガラスに関連して、発生する一般的な問題は、カバーガラスを活性化ガラスにポリアクリルアミドを結合する、ポリアクリルアミドを活性化し、その後、ポリアクリルアミドにECMを結合する複雑な性質です。一つの特に困難と潜在的に問題のステップは、ポリAの曝露後のフィブロネクチン/ポリアクリルアミドゲル上のHUVECを培養され、2 mMのスルホ - SANPAHにcrylamideコーティングしたカバースリップ（上記のステップ2.2.2.6）。これは、スルホ - SANPAHが完全にECMの共役以下の実験システムから削除され、これらの基板上でのHUVECの培養の成功に不可欠です。これは、最良のddH 2 Oで洗浄し、一晩振盪機上でのddH 2 O中でカバースリップをインキュベートすることによって達成することができます。ポリアクリルアミドのECM上で培養した細胞は生存する、または生存率が予想よりも小さい場合、フィブロネクチン（ステップ2.2.2.9）への結合体化の後にスルホ - SANPAHの洗濯を増加させ、繰り返されない場合は、潜在的にこの問題を軽減することが推奨されます。
プロトコル3（カバースリップ上のcDNAのトランスフェクションおよびHUVEC文化）に関連して、エレクトロポレーション手順の成功に大きな影響をプラスチックフラスコからそれらを削除するには、両方の細胞のトリプシン処理中に、HUVECの取り扱いである、との結論を以下エレクトロポレーションは（上記、3.3から3.4ステップ）。気にすることが重要です完全にトリプシンでながらたHUVECを監視し、フラスコ（通常は1~2分）の表面に「切り上げ」に細胞に必要な時間を超えません。トリプシンでの過度の時間は、典型的には、細胞は、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ（ステップ3.4）上にプレーティングされるまでに実現した後、基板に取り付けられるように失敗していないHUVEC死の主要な原因です。
エレクトロポレーション緩衝液中で長い時間のために中断したときに同じような重要なのは、HUVECを（最も主要な細胞型は）うまくいきません。ユーザは、エレクトロポレーションを必要とする5つ以上の状態を有する場合、より大きな規模の実験の間、例えば、1つずつ、個々のチューブ（トランスフェクションあたり1管）でペレット化した細胞を維持するために、それらを混合した方がよいです、エレクトロポレーションの前にすぐにエレクトロポレーションバッファーインチこのアプローチは、エレクトロポレーションバッファーと最大化HUVECの生存にインキュベーション時間を最小限に抑えます。さらに、完全培養培地中の即時の救助もCRでありますitical以下のエレクトロポレーション。レスキュー1分の遅延または複数、次のエレクトロポレーションは、ほぼ完全なHUVECの死に至ることができますので、避けるべきです。
関連細胞遊走アッセイ（プロトコル9）、極めて高い密度でHUVECを培養する技術は、フィブロネクチンコーティングしたカバースリップの乾燥を必要とする（プロトコル3を参照）、従来のHUVEC細胞培養法の（ステップ9.2に記載の）臨界変形に依存しますカバーガラスの非常に小さな領域にHUVECの培養を可能にするためです。カバーガラスが完全に乾燥されていない場合、またはフィブロネクチンとカバーガラスのコーティングの前には（2.1または2.2ステップ）効率的でなかった場合、多くの場合、カバーガラス上に置かれているメディアを含む細胞は、その表面張力を失い、に拡大しますそれにより、カバースリップ上の細胞の密度を減少させるカバースリップの縁、。この潜在的な問題を解決する一つの方法は、その後、カバーガラスからメディアを吸引することであり、5-10分間のバイオセーフティキャビネットの背面に（まだ35ミリメートル皿で）カバースリップを配置。この適応は、皿を乾燥させるのを助けるために、キャビネット内の空気の流れを可能にするように助けることができます。目に見える液体が空気乾燥した後、カバーガラス上に残っている場合、液体スポットを吸引し、再び生物学的安全キャビネットの中5-10追加分間風乾させます。完全にこの潜在的な問題を回避する方法がないことに注意することは重要ですが、それはプロトコルの反復練習の問題のあまりになるん。これは、余分なカバースリップを準備し、道に沿って問題が発生した場合には、すぐに行く余分たHUVECを持つように、（一般的に、または任意のアッセイ）細胞遊走アッセイのためにカバースリップを準備するときようにしても、トラブルシューティングの推奨事項です。
念頭に置いてこれらのトラブルシューティングの考慮事項と、議論のプロトコルおよび将来の細胞生物学研究におけるその意味の有用性を強調することも重要です。 polyacrへの適用イルアミドアプローチは、広範囲であり、（上述の）細胞ECMの関与の二次元の研究だけでなく、三次元の調査5だけでなく、。このアプリケーションは、HUVECを、生理的環境での細胞の形状および遊走を調節する方法の我々の理解を高めることに重要であると研究者らに細胞骨格の変化に調整されているかの形態学的変化の基本的な理解を提供する必要があります。ここで説明するプロトコルは、MTの増殖動態の測定に焦点を当てているが、プロトコルの大部分は、細胞 - ECM相互作用の他の微視的測定可能な態様の任意の数を測定するように適合されるべきであることができます。 MTダイナミクスに関しては、提示されたプロトコルを使用して調べることができ、少なくとも14キネシン89の家族、HUVEC極性と向かう移行に貢献する潜在的な役割を持つ各、すべてのを含め、多数のMAPがあります。
今後の捜査すべきLSO疾患状態正常対に細胞ECMの関与を対象とします。ここで提示HUVECプロトコルは少数を示すために、正常な血管恒常的プロセスの調査に、だけでなく、心臓病、網膜症、腫瘍の増殖と転移を含む疾患状態に適用可能です。顕微鏡的研究と従順準拠のコンジュゲートする目に見えて透明のECMおよびポリアクリルアミドの基板は、内皮細胞の血管の血管新生が高い空間分解能と時間分解能で監視することができるような細胞ECMエンゲージメント研究のためにできるようになります。実験的アプローチのこれらのタイプは、すでに重要な内皮細胞形状の違い、極性、遊走、及びこれらのプロセス5,31,90を調節するタンパク質の影響を明らかにするために始めています。今後の取組みは、ECMのコンプライアンスと次元mechanosensingの組み合わせが局所的に標的とし、細胞骨格の動態を調節するタンパク質を制御する働きをすることができる方法を特定することを目指すべきです。
Acknowledgments
plusTipTracker MT解析ソフトウェアを開発するために、これらの研究に用いられる蛍光cDNA構築物の多くの、そしてキャサリンアップルゲートとGaudenz Danuserを提供するための指導や議論のための博士クレアM.ウォーターマン、ミシェル・ベアードとマイク・ダビッドソンに感謝します。この作業は、部分的には、国立心臓肺血液研究所（NHLBI）と国立衛生研究所（NIH）からKAMへの助成金によって、サポートされていました。 （グラント：4K22HL113069）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
| 2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
| 3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
| 405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
| anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
| ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
| ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
| ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
| ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
| Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
| Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
| EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
| Fetal bovine serum 25 ml | |||
| Bovine brain extract 2.0 ml | |||
| Gentamycin sulfate 0.5 ml | |||
| Epidermal growth factor 0.5 ml | |||
| Hydrocortisone 0.5 ml | |||
| Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) 10.0 ml | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
| Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
| HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
| HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
| Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
| Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
| Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
| Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
| Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
| Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
| Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
| Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
| Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) | MP Biomedicals | 91670249 | |
| Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| plusTipTracker | |||
| Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
| Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
| Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
| Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
| Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin | Corning | MT25053CI | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |
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