Introduction
Anjiyogenezis, polarize yönlü özgüllük ile göç ve kan temini gerektiren dokularda yeni damar sistemini oluşturmak için endotel hücreleri (EC) teşvik hücre dışı bir sinyal ipuçları ile tetiklenir. anjiogenezisi sürücü düşünce katkıda bulunan faktörler ekstrasellüler matriks (ECM) gelen sinyaller bulunmaktadır. Fiziksel uyaranlara yanıt olarak, EC damar ağı 1,2 oluşumunda yönlü hareketini yönlendirmek için yönlendirme spesifikliği olan şube uzanır. AK morfolojisi ve dallanma mimari acto-miyozin kasılmasının 3 düzenlenmesi ile koordineli bir şekilde mikrotübül (MT) hücre iskeletinin lokalize yönetmelikle belirlenir. Oluşturmak için AT dalları için, miyozin II yerel bölgesel membran çıkıntılar 4 sonuçlanan aşağı regüle edilmesi gerekmektedir. Aynı zamanda ve hücre içinde aynı yerde, MT büyüme dinamikleri şube Elon teşvik etmek yavaş ve kalıcı MT büyüme ile sonuçlanan değiştirilmiş halinegasyon ve stabilite 5. Bu koordine iskelet düzenleme EC yönlü göç kolaylaştırmak için kendi morfolojisi polarize sağlar.
Kutuplaşmış bir hücre morfolojisi gelişimi polarize MT takımını 6 gerektirir. Epitel hücreleri göç olarak, MTS hücrenin 7-9 öncü yavaş ve ısrarla özellikle büyümek; nöronlarda iken, akson veya dendrit başlaması ve uzama MTs sadece mevcut olmasını gerektirir, fakat onlar dinamik montaj ve demontaj 10-15 süreçlerini geçiyor. Bu şekilde, MT büyüme dinamiği lokalize kontrol hücre yapısını tespit eder ve EC bunların ECM gezinirken hücre morfolojisi hızla yeniden sağlar.
MT büyüme dinamikleri moleküler motor protein ve non-motor proteinlerin aileleri tarafından düzenlenir, Mikrotubul İlişkili proteinler veya Mikrotubul Etkileşen Proteinler (bundan sonra refe olarak adlandırılan) MAP'ler olarak rred. MAP yerel olarak, tipik olarak, hücre-ECM arayüzü 16,17 başlatılan sinyal basamaklarının ile, aktive edilmiş ya da inaktive edilebilir. MT bağlanarak ve MT montaj ve demontaj kinetik değiştirerek kez aktif MAP fonksiyonu; böylece lokal hücre şekli ve kutupları 18-20 teşvik etmek amacıyla MT dinamiklerini düzenleyen işleyen. Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) MT uçları ve çiftler MT sökme 21-23 ATP hidroliz bağlanan bir kinesin-13 aile MAP olduğunu. MCAK bu fonksiyonel rolü mitotik iğ 24-28 olan kritik olarak interfaz 29,30 ne olduğu bilinmektedir. interfaz EC içinde MCAK aracılı MT demontaj yara kenardan Rac1 küçük GTPaz indükte aktivasyonunu yanıt olarak MCAK lokalize Aurora-A indüklediği fosforilasyon ile düzenlenir. Bu sinyal akışının sonucu le doğru polarize MT büyümesi ile sonuçlanan, EC ön kenarında MCAK inhibisyonuECS 31 göç firar kenarında kenar ve MCAK kaynaklı MT sökme ading.
MT büyüme dinamiği ölçmek için geleneksel yöntemler, tipik olarak floresan etiketli tübülin ya da daha yakın zamanda, floresan etiketli MT sonu bağlayıcı protein 1 ya da 3 (sırasıyla EB1 ve EB3) ya da el izleme kullandık. floresan tubulin yaklaşımı tüm MT dizi etiketleme avantajına sahiptir. Mitotik hücre türlerinin çoğunluğu interfaz 8,32,33 sırasında MTS radyal sırasını korumak için, ancak, sentrozom civarındaki MTS çok yoğundur ve sonuç olarak, flüoresan tubulin MT büyüme ve sökme izleme, genellikle çevre sınırlıdır hücrenin bölgeleri. Bu kısıtlamalar nedeniyle, floresan etiketli EB proteinlerin (EB1 veya EB3) kullanım MT dinamiklerini ölçmek için daha ortak bir yaklaşım olmuştur. EBS sadece MTS büyüyen artı uçları etiket çünkü onlar parlak floresan gelip, (1-3 mikron) küçük görünürts, son derece sınırlı eşiğe 34-37 MT polimerizasyon kolayca ayırt edilebilir işaretleyici sağlar. MT dizinin yalnızca bir alt kümesi EBS etiket EB yaklaşımının önemli bir gücü temsil olması, aynı zamanda önemli bir sınırlama vurgular iken, non-büyüyen MTS EB3 yaklaşımla etiketlenmiş değildir. Bununla birlikte, ölçmek ve zamanla EB3 kuyruklu izlemek ve alt-hücresel bölgelerindeki MT büyüme görselleştirmek için yeteneği MT örgütün bölgesel değerlendirme gerektiren uygulamalar için bu yaklaşım ideal kılar.
Ölçüm MT büyüme dinamikleri açısından geleneksel yöntemlerin bir başka kritik sınırlama çok büyük veri setleri ve veri analizi için gereken zaman olmuştur. Bu sınırlama yüksek zaman çözünürlükte EB kuyruklu yüzlerce el izleme ihtiyacından kaynaklanıyor. Ayrıca, bu ölçümler hücrelerin istatistiksel olarak önemli sayıda yapılır ve aynı zamanda kontrol ve experime çeşitli altında gerçekleştirilmesi gerekenntal koşullar. Son zamanlarda, bu kısıtlamalar canlı hücreler 35 time-lapse mikroskopi kullanılarak özellikle izleme EB3 kuyrukluyıldızların yönelik hesaplama analiz teknikleriyle aşılmıştır. Uygun kullanıldığında, bu hesaplama yaklaşım hem MT polimerizasyonu ölçme yüksek verimli bir yöntem sağlamanın yanı sıra el-izleme ile ilişkili insan hatası potansiyelini sınırlamak için hizmet vermektedir. MatLab tabanlı yazılım paketi kullanarak MT dinamiklerinin hesaplama analizleri, plusTipTracker, floresan etiketli EB3 kuyruklu 5,31,35,38 izleme MT büyüme ölçümleri için izin verir. Ayrıca, plusTipTracker yazılım büyüyen MT parça içinde EB3 kuyruklu kayboluşu dayalı MT felaket olaylarının (aka demontaj) hesaplamalarına izin verir, ve ilgi kullanıcı tanımlı bölgeler içinde MT büyüme dinamikleri alt-hücresel (aka bölgesel) analizi için izin verir . Bizim çalışmaları için, MT büyüme dinamikleri içinde karşılaştırıldıdallanmamış bölgelerin karşı veya hücre kenarları arka karşılık gelen olan dallanmış bölgeleri. plusTipTracker yazılım veri çıkışı, aynı zamanda ayrı ayrı hücre ve hücre altı bölgelerde renk kodlu parça bindirmeleri oluşturmak için de kullanılabilir.
Burada MT büyüme dinamikleri ve morfolojisi ve yön göç dallanma AT yönetmeliğine bu MT depolimeraz katkısını modüle MCAK rolünü araştırmak için kullanılan metodolojiyi açıklamaktadır. Yaklaşımımız kolaylıkla kültürlenebilir ve plazmid cDNA elektroporasyon ile indüklenen, geçici transfeksiyon oldukça uygundurlar primer insan hücre hattı, insan göbek damarı endotelial hücreleri (HUVECler) kullanılmıştır. Daha sonra yüksek çözünürlüklü kullanılan protein 3 (EB3) ve Mitotik Sentromer İlişkili kinesin (MCAK) 'e özgü cDNA Bağlama MT sonu ile transfekte HUVEC zaman atlamalı floresan mikroskopi MT dinamikleri üzerindeki etkileri HUVECler transfekte değerlendirmek oluşturur. EB3 ve PlusTipTracker tabanlı hesaplama görüntü analiz-etiketli MT artı uçları ölçmek ve MT büyüme dinamikleri üzerinde deneysel manipülasyon etkilerini karşılaştırmak için, zaman atlamalı görüntüler MT büyüme hızları ve MT büyüme ömürleri ölçmek oldu. Bu metodoloji MT dinamiklerinin çalışma ve alt-hücresel bölgelerindeki MT dinamiklerinin lokalize düzenleme AK dallanma ve göç anjiyogenik süreçlere nasıl katkıda tanımlanması için izin verir. Bu teknikler floresan canlı hücreler etiketli ve ifade edilebilir herhangi MAP soruşturma için de geçerlidir.
Protocol
1. HUVEC Kültür ve Bakım
- (Detaylar için Malzemeleri / Ekipman listesine bakınız) kırmızı ücretsiz endotel bazal ortam fenol endotel hücre büyüme ortamı takviyesi paketi ve% 5 penisilin / streptomisin antibiyotik karışımı tüm içeriğini ekleyerek tam endotel bazal orta hazırlayın. Bir su banyosu içinde 37 ° C'ye ısınmaya tam endotel bazal ortam.
- Sıvı azot depolama bir HUVEC cryovial çıkarın ve 2 dakika için 37 ° C su banyosu içinde hızla çözülme. ~% 80-90 çözülmüş zaman, cryovial ısıtılmış tam endotel bazal orta 500 ul ekleyin pipetleme karıştırın ve ısıtılmış tam endotel bazal orta 15 ml içeren bir 100 mm plastik doku kültürü çanak içine eşit hücreleri dağıtmak.
- % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör içine yerleştirin hücreleri. Hücreler gecede uymak için izin ver. kaldırmak veya hücre kültür ortamı değiştirmeyin.
- 100 mm çanak>% 90 konfluent olduğunda, HUVECler i aktarmakve 75 cm 2 doku kültürü tedavi şişesi nto her zaman 60> adresinden% izdiham korumak (adım 1.5 bakınız).
Not: Bir yoğunluk>% 60 muhafaza zaman HUVEC iki katına çıkma süresi sürekli 18-20 saat olduğunu.- (Yoğunluk <% 90 yani) hücreleri pasaj gerekli değildir durumlar için, orta aspire ve taze tam endotel bazal orta her 48 saatte değiştirin.
- HUVECler>% 90 kaynaşmaya eriştikten sonra, 1 x 10 ml PBS ile 2 kez yıkayın ve daha sonra 37 ° C'de 1-2 dakika boyunca her 1.5 mi% 0.25 tripsin muamele etmek suretiyle doku kültürü çanağı hücreleri çıkarmak. Not: HUVEC canlılığı ölçüde tripsin maruz kalma süresini uzatarak azaltılır.
- 4 bir oranda tripsin / HUVEC karışımına 8.5 ml komple endotel bazal ortamı ekleyerek kurtarma hücreleri: 1 endotel bazal ortamda da: tripsin (minimum oranı), ve 15 ml konik bir tüp içinde toplar.
- 4 dakika boyunca 1400 x g'de santrifüjleyin. soluklusüpernatant.
- Tam endotel bazal ortam, 2 ml pelletini ve tam endotel bazal ortamı 25 ml içeren yeni bir 225 cm2 doku kültür şişesine hücreleri ekleyin.
HUVEC Kültür 2. Coverslip Hazırlık önce
- Fibronektin Yüzeyler ile Kaplama Lameller.
- % 100 etanol içinde oda sıcaklığında (RT) tertemiz 22 mm No. 1.5 lamelleri 39 ve mağaza hazırlayın.
- lamel Alev ve cımbız kullanarak 35 mm petri içine yerleştirmek için Bunsen beki kullanın.
- PBS 990 ul fibronektin stokunun 10 ul (1 mg / ml) karıştırılarak bir fibronektin / PBS karışım hazırlayın.
- Pipet 35 mm çanak lamel üzerine fibronektin / PBS karışımı 250 ul. lamel yüzeyini kapsayacak şekilde yayılır.
- 37 ° C'de 3 saat ve en az bir yemek inkübe ve kullanımdan önce 1 x 2 ml PBS ile 3 kez yıkayın.
- lamel Aktivasyon
- Bir karıştırıcı plaka üzerinde 10 dakika boyunca% 50 3-aminopropyltrimethyloxysilane bir 22 mm No. 1.5 lamel yerleştirin. İnkübasyondan sonra, her 2 dakika için 10 kez yıkayın iki kez damıtılmış H2O (GKD 2 O).
- Bir karıştırıcı plaka üzerinde 30 dakika boyunca% 0.5 glutaraldehid içinde lamel inkübe edin. İnkübasyondan sonra, GKD 2 O 2 dakika için 10 kez yıkayın
- poliakrilamid Hazırlık
- , 3.75 ml% 40 akrilamit eklenerek 0.7 kilopaskal'dır (kPa) bir uyum ile bir PA jel hazırlanması 0.3 ml% 2 bis-akrilamid ve GKD 2 O 0.95 mi
- amonyum persülfat (APS)% 10 çalışma çözeltisi hazırlayın ve kullanılıncaya kadar buz üzerinde saklayın.
- GKD 2 O 0.83 ul, bis-akrilamid çözeltisi 41.7 ul, 1 lamel (toplam hacim = 166.7 ul) PA çözelti hazırlamak için,% 10 APS 124 ul (aşama 2.2.2.1 yapılmış) veTEMED 0,25 ul.
- Hemen bir hidrofobik cam slayt üzerine PA solüsyonu 15 ul pipetlemeyin (Reaktifler listesi) ve bir aktif 22 mm No. 1.5 lamel ile kaplayın. PA, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca polimerize olmaya bırakın.
- lamel çıkarın ve bir 35 mm çanak aktarın. 1x PBS ve 2 ml ile 3 kez yıkanır. 4 ° C'de <2 hafta içinde depolayın.
- poliakrilamid jel fibronektin bağlamak için, UV ışığının 7500 J (254 nm), 2 mM sülfo-SANPAH poliakrilamit kaplı lamelleri maruz kalmaktadır. GKD 2 O. ile bir kez durulayın
- PBS 990 ul fibronektin stokunun 10 ul (1 mg / ml) karıştırılarak bir fibronektin / PBS karışım hazırlayın.
- Pipet, 35 mm Petri kabındaki lamel (ler) üzerine fibronektin / PBS karışımı 250 ul. lamel yüzeyini kapsayacak şekilde yayılır.
- 37 ° C'de 3 saat ve en az bir yemek inkübe ve kullanımdan önce 1 x 2 ml PBS ile 3 kez yıkayın.
- Komple adımlar 1,5-1,6.
- hemasitometre kullanarak hücre sayısını ve 100.000 hücre / (non-göç deneyler için) lamel veya (göç deneyleri için) 500.000 hücre / lamel içeren bir hacim toplamak. 4 dakika boyunca 1400 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
Not: Göç protokol aşağıda bölüm 9 açıklanmıştır. - Süspanse hücreler 100 ul elektroporasyon tamponu ile transfekte edilmesi. 1 ug cDNA ile birleştirin ve elektroporasyon küveti içine yerleştirin. Electroporate hücreler: HUVEC elektroporasyon için belirlenen bir program (A-034 gibi bir program #) kullanarak DNA karışımı.
- Kurtarma (yukarıda, Protokol 2.1) bir fibronektin kaplı 22 mm No. 1.5 lamel üzerine 500 ul tam endotel bazal orta ve plaka hücreleri hücreleri transfekte. cDNA yapılarının ifadesi için zaman tanımak için 3-4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 2.5 cm x 0.65 cm şeritler halinde çift taraflı bant kesti.
- temiz bir cam slayt edinin. çift taraflı iki şerit alın ve slayt üst ve alt kenarı boyunca yatay olarak sabitleyin. Not: adım 4.5) de tarif edildiği gibi haznesi sızdırmaz kılınması için bant ve slayt kenarı arasındaki boşluk küçük bir miktar sağlamak için önemlidir.
- (Adım 3.4 den hücre tarafı aşağı) Dağı lamel kasete lamel dinlenme öyle ki 2 kenarları. lamel sabitlemek için hafifçe bastırın için forseps kullanabilir.
- Görüntüleme orta 40 ul ekleyin, bir mikropipet kullanarak lamel ve slayt arasındaki (tam endotel bazal ortam 25 uM HEPES). lamel ve slayt arasındaki boşluk tamamen görüntüleme ortamı ile dolu olduğundan emin olun. Aspire fazla görüntüleme ortamı (gerekirse).
- (1: 1 vazelin: lanolin: parafin 1) sıcak valap tüm kenarları mühür. gentl iterek sızıntı olup olmadığını kontrol edincam lamel y.
- monte ve önceden ısıtılmış (37 ° C) mikroskop sahneye lamel mühürlü yerleştirebilirsiniz.
5. Mikroskopi
- 60X, 1.40 sayısal açıklık (NA), farklılık belirleyici kontrast (DIC), yağ daldırma objektif lensi, otomatik bir odaklama izleme sistemi (PFS), iletilen aydınlatma elektronik kapak ile teçhiz edilmiş bir dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak bir X ve Y motorlu sahne, bir elektronik filtre simidine yerleştirilmiştir bant geçiren filtreler ve monolitik bir lazer birleştirici modülü, hücre / lamel arayüzünde mikroskop odak ve bir tek hücre bulmak için mikroskop sahne joystick'i kullanın.
- görüntü yazılımı programında "Kamera Ayarları" panelinde tıklayın. Kamera Ayarları panelinin "maruz kalma süresi" açılır pencere içinde, 400 msn seçin.
Not: Pozlama süreleri değişebilir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. - içinde "ND Toplama" panelinde tıklayınGörüntü yazılım programı. ND Toplama panelinin lambda (λ) sekmesi içinde, 488 ve 561 nm lazerler seçmek için onay kutularını tıklatın. ND Toplama panelinin "zaman" sekmesinde, 2 saniye ve 2 dakika toplam zaman satın alma zamanını ayarlayın.
- hem 488- ve 561 nm aydınlatma için 400 milisaniye pozlama süresi ile 2 sn edinme aralıklarla 2 dakika time-lapse görüntü sırası elde etmek için ND Acquisition paneli içinde "Şimdi Çalıştır" düğmesine tıklayın.
- "Optik Yapılandırma" görüntü yazılım programının panel ve aşama 5.2'de açıklanan kamera ayarlarını kullanarak, mavi floresan proteininin tek bir görüntü yakalamak için "Acquire ardından" 405 nm lazer butonuna tıklayın ve (BFP) -etiketli proteinler .
Not: cep poz zamanla hücrelere zarar verebilir, bu dalga boyu olarak 405 nm lazer aydınlatma için (görüntü yakalama ve / veya maruz kalma süresi sıklığını) sınırlamak için genellikle tavsiye edilir.- MCAK-ShRNA çalışmaları için, birBFP etiketli shRNA ekspresyonunu doğrulamak için, tek bir 405 mil görseli cquire.
- Görüntü yazılım programının "Optik Yapılandırma" panelinde ve morfoloji analizleri dallanma hücrenin tek bir DIC görüntü yakalamak için "Acquire ardından" DIC butonuna tıklayın ve adım 5.2'de açıklanan kamera ayarlarını kullanarak (bakınız bölüm 10 , altında).
- görüntü elde etme ardından, dijital görüntü sinyalini arttırmak için resim yazılım programında "parlaklık / kontrast" işlevini kullanın.
- parlaklık ve kontrast ayarlı görüntüleri ihracat. "Dosya" ardından "Farklı kaydet" daha sonra görüntü dosya türü için ".tif" seçmek için tıklatın.
Not: Adım 5.4 tarif edildiği gibi yakalanan Bu genellikle tek bir 2 dk time-lapse alımından kaynaklanan 61 tif görüntü dosyaları oluşturur.
6. MT Dinamiği Analizi
- EB3 izleme için plusTipTracker yazılımı 35 kullanımı, açık kaynak kodlu,otomatik algılama, izleme, analiz ve floresan etiketli EBS görüntülenmesi için tasarlanmış Matlab'ı tabanlı hesaplama yazılım paketi.
- plusTipGetTracks Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI)
- plusTipGetTracks GUI yazın plusTipGetTracks erişmek için.
- EB3 kuyruklu tespiti için, göz ve .tif görüntülerini içeren üst dizini seçmek için GUI kullanın.
- plusTipGetTracks GUI izleme parametreleri paneli içinde, aşağıdaki değerleri girin: Arama Range Radius = 5 - 10; Asgari Alt Parça Uzunluğu = 3; Max Gap Uzunluk (Çerçeveler) 12 =; En Büzülme Faktörü = 1.0; Maksimum Açı İleri 25 =; Maksimum Açı Geriye = 10; Dalgalanma Radius (Piksel) 2 =; Frame Rate (sn) 2 =; Piksel Boyut (mm) = 110.
Not: İlk tif görüntü dosyaları temsili sette plusTipParamSweepGUI kullanarak optimum izleme parametreleri kontrol edin. Piksel boyutu için girilen değer time-lapse görüntü elde etmek için kullanılan objektife özgüdürs (yukarıda Adımları 5.1-5.2 bakınız). - İlgi (YG) seçimi Bölge için, elle bir çokgen oluşturacak şekilde hücrenin DIC görüntü kullanılarak hücre kenar takip ederek tüm hücrenin ikili maskeler oluşturun.
- İlgi (alt ROI) seçimi Alt Bölgesi için, lider ve elle modifiye plusTipTracker alt ROI seçim aracını kullanarak ilgi yara kenarı hücrenin üzerinde 2 nokta kalın bir çizgi çizerek kenar maskeleri firar oluşturun.
Not: Satır ilgi hücre yara kenar hücreleri 31 komşu ötesinde pozisyonda yara kenarına paralel çizilmelidir.
- plusTipSeeTracks GUI
- Doğrulamak ve görsel tıklayarak "ROI" klasöründe saklanır .tif görüntülerin iz bindirmeleri incelemek Parça Kaplamaları sütununda renkli "Plot Tracks". tüm parça bindirmeleri için tekrarlayın.
- İsteğe bağlı Ayarlar sütununda "Create Gruplar" düğmesini tıklayarak veri gruplandırma gerçekleştirin. experim seçinveri dosyaları tıklayarak aynı veri kümesine ait ental verileri. "Grubu" kolayca (örneğin, "kontrol grubu") tespit edilebilir bir ad vererek seçimi kaydedin.
- Görüntü bir EB3 kuyruklu parça ön ve arka kenar ROI içinde MT büyüme geziler bir "parça" olarak nitelemek ve ayıklamak amacıyla alt ROI içinde tespit gerektiğini çerçeveleri Alt ROI MT büyüme dinamiklerinin ölçümler için, asgari numarasını girin GUI "Alt ROI" panel içinde "manuel seçim" üzerine tıklayarak.
Not: Örneğin, bir şekilde ayıklanır asgari algılama uzunluğu 3 kare (6 sn) kullanın "track." Alt ROI çıkarılan parçalar, her bir hücre için orijinal ROI klasörü içinde bir alt-proje klasörü içinde saklanır. - MT büyüme alt parça ve alt-populasyonda analizi
- ste (bkz ortalama MT büyüme hızını hesaplamak ve her ROI için "grup" veri setleri (adım 6.3.2 bakınız), MT büyüme ömrünü ortalamaVe her bir alt-ROI p 6.2.4) () adım 6.2.5 bakın.
- plusTipSeeTracks GUI Quadrant Dağılım Arsalar sütun içinde, "Select Grupları" üzerine tıklayın ve karşılaştırılacak (Adım 6.3.2 oluşturulan) gruplarını tıklayın.
- x-ekseni seçeneği için "Büyüme hızı" i seçin ve kutunun içine (Adım 6.3.4 itibaren) büyüme hızı ortalama değerini yazın. y ekseni seçeneği için "Büyüme ömür boyu" i seçin ve kutunun içine (Adım 6.3.4 itibaren) büyüme ömrü boyunca ortalama değer yazın.
- için "Başlat / sonunda parça Kaldır" yanındaki ve yanındaki kutuyu işaretleyin "Gruplar Toplu işlem." MT büyüme bütün hücre için parçaları, önde gelen kenarları için bir dağıtım profili oluşturmak için "Arsalar olun" üzerine tıklayın ve arka kenarları alt ROI.
Not: Burada açıklanan çalışmalar için, MT büyüme parça dört alt popülasyonlar halinde dağıtılır: yavaş ve kısa ömürlü, yavaş ve uzun ömürlü, hızlı ve kısa ömürlü, hızlı ve uzun ömürlü. - Tıklayın "Veri," sonra Veri açılır penceresinden "Veri Analizi" üzerine tıklayın. "T-testi: Eşit varyanslar varsayarak iki örnek" seçeneğini seçin MT büyüme hızları ve MT büyüme ömürleri ortalama karşılaştırmak. t-testi karşılaştırmaları p değerinin <0.001 sonuçlanır tablo içinde veri hücreleri vurgulayın.
7. ko Analizi
- Arka plan çıkarma için görüntüleme yazılımı programı "satırı aracı" kullanılarak, yeşil kanal görüntü (488 nm uyarma) 10 mikron 2 bir kare şekil oluşturmak için ekrandaki tıklayarak İlgi (ROI) bir bölge çizmek hiçbir hücre floresan (arka plan) olduğu bir pozisyon. Adım 5.8 görüntüleri kullanarak kırmızı kanal görüntü (561 nm uyarma) için bu işlemi tekrarlayın.
- görüntüleme yazılımı pr kullanarakOgram, sağ adım 7.1 den ROI tıklayın ve "arka plan ROI olarak ayarlayın." tıklayın "Görüntü" ardından bütününden (Adım 7.1 dan itibaren) ortalama arka plan değerlerini çıkarmak için açılır penceresinden "çıkarma arka plan" üzerine tıklayın görüntü. Em-Aurora ve ya mCherry MCAK, MAPPLE-EB3 veya MAPPLE-tubulin ko-eksprese eden hücreler için arka plan çıkarır.
- arka plan çıkarılır kırmızı kanal görüntüde sadece, İkili şerit üzerine tıklayın ve "Eşik tanımla" seçin ve ardından belirlenen floresan işaretleyici dışlamak için "kanal başına" işlevini seçin.
Not: eşikleme adım, özellikle co-lokalizasyon analizi (adım 7.4) için eşiklenir nesne işaretlenmiş çizgiler çizerek izin MCherry-MCAK, Mapple-EB3 veya MAPPLE-tübülin görüntü ya gerçekleştirildi. - görüntüleme yazılımı satırı aracını kullanarak, eşiklenir görüntü içinde dışlanan nesnelerin üzerine 2-noktalı kalın bir çizgi çizin.
- Adım 7.4 çizilen çizgi nesneleri seçin. Kopyala ve karşılık gelen yeşil kanal (Em-Aurora A) görüntü üzerine kırmızı kanaldan çizgi nesneleri yapıştırın.
- hat görüntüleme yazılımı programı içinde açılır penceresinden ", ölçün" sonra "Yoğunluk Profili" seçerek her bir hücre için ortak yerelleştirme ve toplam Em-Aurora-A değerlerini hesaplamak için nesneleri altında gri tonlama piksel yoğunluğu değerlerini ölçün.
- ( "Control_grayscale_intensity.xls" örneğin) bir tablo yazılım programı ihraç ve tipi .xls olarak kaydederek deneysel tedavi ve alt hücresel bölgelere göre verileri düzenlemek.
Not: Bu şekilde sunulan veriler alt hücresel bölge başına toplam ölçülen Em-Aurora-A eş-lokalizasyonu bölümünü temsil eder.
- ( "Control_grayscale_intensity.xls" örneğin) bir tablo yazılım programı ihraç ve tipi .xls olarak kaydederek deneysel tedavi ve alt hücresel bölgelere göre verileri düzenlemek.
- Adım 7.6 tekrarlayın adım 6.3.7 ölçülen değerleri kullanarak önemi için kesim olarak p <0.05 kullanılarak istatistiksel anlamlılık hesaplamak için.
- paraformaldehit / glutaraldehit ko-çıkarma / sabitleme tamponu (PGF-PHEM hücreleri (adım 3.4) Fix,% 4 paraformaldehid,% 0.15 glutaraldehit,% 0.2 deterjan 60 mM BORU, 27.3 mM HEPES, 10 mM EGTA ve 8.2 mM MgSO içinde 4, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, pH 7.0).
- 1x PBS ve 2 ml, 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- Reaktif aldehidler söndürmek için 0.01 g / ml NaBH4 1x PBS ile 15 dakika süreyle 2 kez tedavi edin.
Not: lamelleri yüzer neden olabilir NaBH4 formları kabarcıklar. Lamelleri bu inkubasyon sırasında sular altında kalması çok önemlidir. lamelleri float başlarsanız, kabarcıklar kaçmasına izin için lamel bir kenarını yükseltmek için forseps kullanabilir. - Oda sıcaklığında 1 saat için sallanan bir platform üzerinde 1 x PBS içinde% 5 yağsız süt ile bloke önce 1x PBS ile 2 kez yıkayın.
- (Ve sıçan anti-α-tübülin: Primer antikor hücreleri (1000), tavşan anti-pT288-Aurora A (1) inkübe1: 1 x PBS çözeltisi hazırlanmıştır 500). sallanan bir platform üzerinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 2 saat boyunca,% 5 yağsız süt içinde hazırlanan sekonder antikor ile inkübe edilmeden önce, 1 x PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez Primer antikor çıkarın ve durulama (1000) eşek anti-tavşan (1: 1000) ve keçi anti-fare (1) 37 ° C'de ilave edildi.
- floresan optimize montaj ortamında bir cam slayt üzerine monte lamel. 4 ° C'de karanlıkta net oje kullanarak slayt ve saklamak için lamel kenarları mühür.
9. hücre gücü deneyi
- Yukarıda açıklandığı gibi göç deneyleri için HUVEC kültürünü gerçekleştirin (Protokolün 3: lamel cDNA Transfeksiyon ve HUVEC Kültür 3.2-3.3 Steps).
- hücre transfeksiyonu, 80 ul tam endotel bazal orta kurtarma transfekte hücreler ardından. kuru bir fibronektin kaplı 22 mm yuvarlak No 1.5 lamel merkezi üzerine tek bir damla olarak 80 ul örnek Pipet. 80 ul dro yaymazlars. konfluent tek tabaka içine hücre yapışması için zaman tanımak için 3-4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
Not: lamel kurutma lamel temas üzerine yayılmasını 80 ul düşmesini önlemek için gereklidir. Bu yaklaşım, HUVECler lamel küçük bir alan içinde konsantre edildi imkan vermektedir ve böylece hücrelerinin konfluent tek tabaka hızlı oluşumunu destekler. - un bağlı hücreleri çıkarmak için tam endotel bazal ortamda 2 kez durulayın.
- "Yara kenar" a oluşturmak için yavaşça (Adım 9.2) HUVEC tek tabaka boyunca temiz bir jilet sürükleyerek bir steril jilet lamel kazıyın. kazıma sırasında jilet kaymasını önlemek için forseps ile yerine hafifçe lamel tutun.
- Hücreler, 3 saat süreyle 37 ° C kuluçka makinesi içinde geri izin verin. Birleştirin ve görüntüleme için lamel (ler) monte (Protokol 4'e bakınız).
- Bir kullanarak mikroskop 12 saat boyunca 10 dakika aralıklarla faz kontrast ve 488 nm görüntü elde10x 0.45 NA faz objektif ve görüntü elde etme yazılım programı "ND Toplama" panelini kullanarak bir 0.52 NA LWD kondansatör (Adım 5.3 anlatılmıştır).
HUVEC Dallanman ve Göç 10. Niceleme
- analiz dallanma ve hatta hücre aydınlatma ve tarafsız ölçümü için, transfekte bir HUVEC mikroskobik bir görüntü elde izin (3.3 adım bakınız) ve MAPPLE-C1 cDNA, bir hücre hacmi işaretleyici inşa ifade etmek için.
- görüntüleme yazılımı programı kullanarak, Mapple-C1 görüntüyü açmak ve membran eğrilik büyük açısını gösterir şube her iki tarafında pozisyon etiket. düz bir çizgi ile bu iki nokta bağlayın. Bu satır "şube kökenli" dir.
- görüntüleme yazılımı satırı aracını kullanarak, görsel Adım 10.2 belirlenen "şube kökenli" uzunluğunda> 10 mikron ölçen dalları tespit. inci mesafeyi ölçerek şube uzunluğunu hesaplamakE şube ucu en uzak noktasına "şube kökenli" (Şekil 4 bakınız).
- elde etmek uzunluğunda> 10 mikron ölçmek dallı çıkıntılar sayısını "hücre şube sayısını."
- Deney içeriyorsa göç analizi için, Adım 9.6 toplanan görüntüleri kullanarak, görsel, fiziksel yere göre (yara kenarında fiziksel yani hücreleri) ve ifade profili bir yara kenar HUVEC belirlemek (yani, yeşil yara kenar hücreyi seçin GFP ifade).
- görsel çekirdeği (hücre merkezine yakın yarı saydam küresel bir yapıya) tanımlamak, hücrenin faz-kontrast görüntülerini kullanarak, ve sonra görsel olarak nükleolusa (çekirdek içinde bir küçük, koyu renkli, küresel yapı) tanımlamak time-lapse görüntüleri ilk kez noktası. Çekirdeklerin x ve y koordinatları etiket çekirdekçik pozisyonuna tıklayın.
- görüntüleme yazılımı kullanarak, el-izlemekZaman atlamalı film (Şekil 4) her karesinde Çekirdekçiğin x ve y koordinatları etiketlemek için Çekirdekçiğin pozisyonuna tıklayarak ardışık time-lapse görüntüleri nucleolus.
- görüntüleme yazılımı kullanarak, "Dosya" tıklatın .xls "sonra görüntü dosyası türünü seçmek için tıklayın" Kaydet üzerine tıklayın. "
- Bir tablo yazılım programı kullanarak (adım 10.8 itibaren) el izleme veri dosyasını açın. Ortalama göç hızı hesaplayın ve kökeni göç mesafesi anlamına gelir.
- Bir tablo yazılım programı kullanarak, ardından Veri açılır penceresinden "Veri Analizi" üzerine tıklayın ", Veri" üzerine tıklayın. istatistiksel anlamlılık için kesim olarak>% 95 güven varyans testi Bonferroni düzeltmeli, tek yönlü analizini seçin.
Representative Results
canlı hücre mikroskopi için HUVEC kültürü
Floresan proteinleri eksprese HUVEC'lerin canlı hücre görüntüleme HUVECler normal hücre büyümesi ve bakımı, hem de normal bir protein ekspresyonu ve işlevi için uygun olan bir ortamda muhafaza gerektirir. 1 protokolünün şematik bir biçimde göstermektedir tamponlanmış hazırlamak için kullanılan göstermektedir ve kapalı sistem canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntüleri toplamak için optik özelliklerini optimize koruduğunu. Çift taraflı bant ince şeritler, bir cam slayt (Şekil 1A) üzerine yerleştirilir ve daha sonra kültüre HUVECler içeren lamel hücreleri slayt (Şekil 1B) bakacak şekilde, bandın üzerine ters çevrilir. Bu şekilde, şerit iki cam yüzeyleri arasında küçük bir boşluk içerir ve hücreler, uygun bir hücre kültür ortamı içinde banyo edilebilir bir alan oluşturur (Şekil 1C, yukarıda, Protokolü 4). benkapalı bir sistem oluşturmak için (Şekil 1D 1 karışımı, valap 1: 1): lanolin: parafin na son adım, cam lamel bir vazelin ile cam slayt kapatılır. Bu hücre kültürü yaklaşımı kısa zaman dizisi EB3 kuyruklu yıldızların görüntüleme ve daha uzun dallanma zaman dizisi ve göç deneyleri için her ikisi için de kullanılmıştır. Ayrıca, valap balmumu benzeri tutarlılık sabitleme ve immüno dahil tamamlayıcı yaklaşımlar (Protokol 8) böyle deney, bir görüntüleme sonunda cam slayt ve lamel kolay çıkarılması için izin verir, aynı lamel ve hücre numunesi üzerinde yapılabilir bu canlı hücre görüntüleme yaklaşımı kullanılarak görselleştirildi.
Şekil 1:. Canlı hücre mikroskopik görüntüleme için HUVEC kültürünün Metodolojisi (A) 0.65 cm x 2 içine çift taraflı bant 2 adet kesin.50 cm dikdörtgen şeritler ve slayt alt kenarı boyunca bir yatay slayt üst kenarı boyunca çift taraflı bant parçası ve diğer parça, sabitleyin. (D) 'de tarif edildiği gibi haznesi sızdırmaz kılınması için bant ve slayt kenarı arasındaki boşluk küçük bir miktar sağlamak için önemlidir. (B) forseps HUVECler içeren lamel kaldırmak ve bant parçaları üstündeki lamel (aşağı hücre tarafı) ters kullanma. Bir mikropipet kullanarak (C), lamel ve cam slayt ile (25 uM HEPES ile desteklenmiş tam endotel bazal ortamı) görüntüleme ortamı 40 ul ekle. lamel ve slayt arasındaki boşluk tamamen görüntüleme ortamı ile dolu olduğundan emin olun ve kabarcıkları önlemek. Gerekirse, aşırı ortamı çıkarmak için lamel kenarı boyunca bir aspiratör kullanın. (D) sıcak valap kullanın (1: 1: 1 vazelin: lanolin: parafin) lamel kenarlarında mühür. görüntüleme medya sızıntı olup olmadığını kontrol edinlamel yavaşça etrafında iterek s. Düzeltmek için ek valap kullanın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
floresan etiketli EB3 otomatik izleme tüm hücre ve bölgesel MT büyüme dinamiklerinin kapsamlı bir analiz sağlar. EB3 protein açık tat ve son derece zaman ve mekan çözülmüş mikroskopik görüntü toplama hücresi içinde EB3 hareketleri analiz için esastır. floresan etiketli EB3 bir HUVEC sentezleme hücre ve floresan yoğunluğu, tipik olarak saatlik bir süre boyunca, aynı hücre içinde artar hücreye büyük farklılıklar gösterir. Nedenle, düşünün ve MT büyüme dinamikleri üzerinde artan EB ifade potansiyel etkilerini belirlemek amacıyla ifade profilinde bu değişiklikleri takip etmek önemlidir. Bu en iyi değerlendiren gri skala floresan intensit gerçekleştirilirY, her bir görüntülü hücre için profiller ve daha sonra, gri ölçekli ekspresyon profilleri tanımlanmış bir dizi sergileyen diğer hücrelere veri analizi sınırlayan. sentezleme profili veri setlerinin ilk değerlendirme kritiktir ve her hücre için plusTipTracker yazılım tarafından elde edilen MT büyüme dinamiği verileri ile karşılaştırılmalıdır. İfade profilleri için gri ölçekli ifadesi istenen aralığını belirlemek ve potansiyel outliers belirlemek için, MT büyüme hızı ve bir deney grubu içindeki her hücre için MT büyüme ömrü karşı çizilebilir.
Bir HUVEC bir fibronektin substrat üzerinde kültüre Şekil 2 vurgular (yukarıda Protokolü 2.1, bakınız) ve MAPPLE etiketli EB3 optimal düzeylerde yakın dile getirdi. Floresan EB3 kuyruklu 12 sn (Şekil 2A) bir süre boyunca bir görüntü zaman atlamalı seri gösterilmiştir. plusTipTracker yazılımını kullanarak EB3 kuyruklu analizi otomatik bir, kare-kare EB3 kuyruklu yıldız DETE içerirction (yeşil ve sarı noktalar, Şekil 2B). Her çerçevesinde tespit edilen kuyruklu yıldızlar daha sonra EB3 parçaları ve görsel EB3 parça bindirme (Şekil 2C-F) üretmek için, çerçeve-kasa gelen pozisyonda kendi değişim bağımlı, bağlantılıdır. Parça bindirmeleri renk kodlu ve renk ayrımları kullanıcı tarafından girilen parametrelere göre belirlenebilir vardır. Genellikle, bu ayrımlar MT büyüme hızı ve MT büyüme ömür boyu 5,31 küresel ortalama kullanabilir ve böylece dört gruba veri split: yavaş ve kısa süreli (kırmızı), yavaş ve uzun ömürlü (sarı), hızlı ve kısa (yeşil) yaşamış, hızlı ve uzun ömürlü MT büyüme (mavi; Şekil 2G). EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin PlusTipTracker aracılı izleme ayrıca İlgi (ROI) kullanıcı tanımlı Bölgeler sağlar. PlusTipTracker böylece MT büyüme dynam karşılaştırmalar için izin, kullanıcı tanımlı ROI (Şekil 2A, B ve F) içinden MT büyüme iz veri ayıklayanAynı hücrede farklı bölgeleri içinde ics.
Şekil 2: EB3 kuyruklu algılama, izleme ve plusTipTracker veri çıkışı bir HUVEC ifade MAPPLE EB3 (A) time-lapse film.. Sol paneli hücre sınırları demarking bir bütün hücre görünümü ve tüm hücre maskesi (beyaz çizgi). Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) 'de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller ardışık görüntüleme çerçeveleri (- t = 12 sn t = 0 sn) EB3 kuyruklu yıldızların ham gri skala zaman atlamalı görüntüleri göstermek. (A) gösterilen görüntülerden EB3 kuyruklu (B) plusTipTracker algılama. Sol panel tespit kuyruklu (sarı nokta) 'in bir tam hücre görünümünü göstermektedir. Kırmızı kutu zaman atlamalı görüntüleri (sağ paneller) 'de gösterilen büyütülmüş bölgeyi temsil eder. Sağ paneller beş algılandı EB3 kuyruklu (kırmızı oklar) vurgulamak ve 12 sn görüntüleme süresi boyunca bu beş kuyruklu iz. Yeşil noktalar önceki zaman aralığında yoktu (ya da tespit edilmedi) EB3 kuyruklu tespit temsil eder. (C) (A) gösterilen EB3 kuyruklu 61 kare (2 dk film) maksimum yoğunluk projeksiyonu. (D) (C) gösterilen aynı 61 kare (2 dk film) ve plusTipTracker MT parça kaplaması. Maksimum intensite projeksiyon (E) Zoom (C kırmızı kutu). Maksimum yoğunluk projeksiyon plusTipTracker MT iz bindirme (F) Zoom (D kırmızı kutu). (G) parça (D) 'de gösterilen bindirmeleri ve (F) için efsane renk kodlu. Tanım olarak yavaş, hızlı, kısa süreli veya uzun ömürlü on MAPPLE-EB3 ifade HUVEC bir grup ölçülen tüm büyüme parçalar için ortalama değeri dayanmaktadır. kolay görselleştirme için, (D) ve (F) 'de parça bindirmeleri (A)' da gösterilen hücre görüntünün ters piksel yoğunlukları kullanılarak oluşturulur. Ölçek çubukları 20 mikron =./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HUVEC dallanma ve göç yolları ECM gelen sinyalleri fiziksel Mechano duyarlıdır.
HUVECler iyi belirli bir sinyal işaret (ler) 36,40-42 uygun bir hücresel yanıt dikte morfolojik değişiklikler geçmesi, bunu yaparken, sinyalizasyon ipuçları çeşitli cevap ve bilinmektedir. HUVECler fibronektin kaplı cam yüzeylerde (Şekil 3A) kültüre, ya da sert 2-boyutlu poliakrilamid ECMs üzerinde (55 kPa), tipik olarak birkaç farklı dallı çıkıntılar (Şekil 3B) ile bir yuvarlak veya uzun morfolojiye sahiptir. Bununla birlikte, kültürlendiğinde çok yumuşak 2 boyutlu poliakrilamit ECMlerin (0.7 kPa) üzerinde HUVECler kaynaklandığı bilinen bir çok dallı morfolojiye sahiptir aşağı uygun kaynaklımiyozin II kontraktilite 4,5,31 (Şekil 3C) düzenlenmesi. Bu nedenle, HUVECler ECM mechanosensing yoluyla hücresel morfoloji düzenler ve bu MT dinamikleri ve akto-miyozin kontraktilite lokalize modülasyonu yoluyla gerçekleştirilir.
HUVECler dallanma HUVEC ölçmek amacıyla, morfolojik nitelikleri geniş bir yelpazede görüntüler Çünkü ilk dallı bir çıkıntı ne olduğunu tanımlamak ve sonra bir dallı çıkıntı objektif ölçülecektir nasıl tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Bir teknik, bir hücre sınırı veya "maske" Hücre kenarlarını (Şekil 3D) tanımlamak için bir flüoresan birim işaretleyici ifade eden bir hücrenin bir görüntü kullanılarak hücrenin kenarlarını takip el ile elde edildiği bir dört aşamalı bir yaklaşım kullanılır. Maske nesil sonra, şube kökenleri dallı çıkıntı ve hücre gövdesi arasındaki eğrilik en büyük açı bulmak ile tanımlanır. Bir çizgi dema çekilirrk "şube kökenli" (mor açılı hatları Şekil 3E). Branch numarası tanımlanan şube kökenli (Şekil 3F) dalların sayısının sayılmasıyla basit ölçülür. Dal uzunluğu uzak kolu ucuna (Şekil 3G) şube kökenli mesafe olarak ölçülür. Veri analizi küçük lamellipodial projeksiyonlar dahil önlemek için, ek kriter onlar ( "şube kökenli" at) geniş daha dalları ( "dal uzunluğu") daha uzun olmalıdır gerektirir ve dalları uzunluğunda 5 en az on mikron olması gerektiğini 31.
. Şekil 3: HUVEC dallara ayırma morfolojisi analizi (A - C) HUVEC DIC görüntü örnekleri fibronektin kaplı cam ECMlerin (A) katı (55 kPa) poliakrilamid ECM'ler (B) ve yumuşak bir kültüre (0.7kPa) poliakrilamid ECM'ler (C). Sert ECMlerin (A, B) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde 0,7 kPa poliakrilamid ECMlerin (C) kültürlenmiş HUVEC artar dallanma. (D). Bir MAPPLE-C1 cDNA inşa ifade eden bir transfekte HUVEC DIC mikroskobik görüntü (sol resim) (hücre hacmi işaretleyici, sağ resim). (Membran büyük eğrilik gösterir pozisyonda yani, mor renkli çizgiler) (E) eğrilik en büyük açı bularak şube kökeni tanımlayın düz bir çizgi ile açıları bağlamak ardından şube her iki tarafında ve (mavi çizgiler) . (F) belirlenmesi ve (E tanımlanan) "dal kökenli" dan> 10 mikron uzatmak dallı çıkıntıları seçilmesi. elde etmek için dallı çıkıntılar sayısını "şube sayısını." (G) mo için "şube kökenli" merkezine uzaklığı ölçünelde etmek için NIS Elements Yazılım açıklamalar ve ölçümler uygulamasında satırı aracını kullanarak şube st uzak nokta "şube uzunluğu." Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
algılama ECM uyulmasının yanı sıra, HUVECler da hissedebilir ve çizik yaralama tarafından uyarılan bitişik hücresel kişileri ortadan kaldırılmasına tepki. göç deneyde, HUVECler bir tek tabaka kültüre bir çizik yaraya maruz ve göç özellikleri (yukarıda, Protokol 9) ölçülür. Tek tabaka kazıyarak yara indüksiyon sonrası, yara-kenar HUVECler yara (Şekil 4A, t = 0 saat) içine uzanan bir çıkıntılı öncü geliştirerek polarize. 10-12 saatlik bir zaman süresi boyunca, polarize yara kenarı HUVECler yara bölgesine göç ve dolguyara, yeni bir konfluent tek tabaka oluşturulması (Şekil 4A, t 11 saat =). HUVEC dallanma olduğu gibi, mevcut delil kutuplaşma ve göç MT koordineli yeniden örgütlenme ve aktin cytoskeletons 43-49 üzerine eleştirel bağımlı olduğunu göstermektedir. Bu, ancak yara kenarı HUVECler 31 arka kenarında, ön kenarda MCAK kaynaklı MT sökme lokalize inhibisyonu yoluyla, kısmen, elde edilir. MT dinamiklerinin hassasiyet, yara ile indüklenen Aurora-A fosforilleyen ve ön kenarında MCAK inhibe kinaz ve MAP inhibe edilmesi veya aktive edebilen diğer kinazlar dahil olmak üzere çok sayıda alt-düzenleyici proteinleri, hedef Rac1 GTPaz tarafından başlatılır polarizasyon yerel MT büyümesini modüle eden ve 18,31,36,48,50-53 büzülme. Kapsamlı deneysel kanıtlar kenar çıkıntısı ön ve arka kenar daralma koordinasyonu Rac1 aktivasyonu döngüleri yoluyla idare olduğu görüşünü desteklemektedirböylece yönlendirilmiş hareketliliği 9,41,51,52,54-58 sürüş firar kenarında acto-miyozin kontraktilite için öncü MT montaj ve RhoA aktivasyonunu teşvik etmek.
Bugüne kadar, hücre göçü otomatik izleme gerçekleştirmek için kurulmuş bir yöntem mevcut değildir. Bu hesaplama yara kenar hücreleri polarize ve göç olarak sürekli değişiyor hücre ECM sınırlarını analiz zorluk bir sonucudur. Birçok yazılım programları floresan etiketli hücreler 59-64 izleme yeteneğine sahip olmakla birlikte, yara kenarı taşıma deneylerinde HUVECler floresan etiketli yığın toplamı HUVEC nüfusun yaklaşık% 30-40, ve bu nedenle yara kenarı hücrelerin çoğunluğu gerekir faz-kontrast ya da DIC görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Ayrıca, yara-kenar göç ölçme belirli belirlenmesi için aynı yara içinde floresan ve floresan olmayan hücrelerin değerlendirilmesi zaman önemlidirİfade etkileri deneysel çalışma grupları dahilinde ve deneysel çalışma grupları arasında hem oluşturur. Şu anda, HUVEC göç ölçmek için en iyi yaklaşım, bir yara kenar hücresi ilk olarak tespit edilir ve daha sonra çekirdek ve nükleolus (Şekil 4B) tespit edildiği bir el izleme yaklaşımının kullanılmasıdır. Çekirdekçik nedeniyle yüksek ışık saçılması yoğunluğu ve göreceli olarak küçük bir boyuta hücre takibi için konum belirleyici olarak kullanılır. Çekirdekçiğin Bu iki özellik daha kolay tespit etmek ve kullanıcı bireysel parça pozisyonları yerleştirebilirsiniz hangi bölgeyi sınırlayarak ölçüm hatalarını azaltmak için yapmak. HUVEC göç parça daha sonra art arda time-lapse görüntü çerçevelerinde çekirdekçik tıklayarak oluşturulur. Son olarak, kökeni göç hızı ve göç mesafesi ölçüldü ve deney ve kontrol gruplarının hücre (Şekil 4B) için analiz edilir.
Şekil 4: yara-kenar HUVEC ve göç izleme analizi çizik yara kenar HUVEC'lere (aka "Göç Deneyi") bir 11 saat zaman atlamalı görüntüleme serisinin (A) 20X faz-kontrast görüntüler.. Göç yara ve yönü paneli t = 0 saatte belirtilmiştir. hücrelerin tek bir tabakası oluşuncaya kadar HUVECler yaraya bir yara kenar ve önceden çapraz gösterilmiştir (t = 3.5 saat - T 11 saat =). (B) geçiş deneyi zaman atlamalı görüntüleme analizi, (A 'de gösterildiği gibi), ilk hücre yere göre bir izlenebilir yara kenarı HUVEC kimlik (fiziksel yara kenarında, yani hücreleri) ve sentezleme profili (mekanizması doğrultusuyla satmaya gerektirir. deney GFP ifadesini içeriyorsa,) yeşil yara kenar hücreyi seçin. Faz kontrastlı görüntü kullanılarak, çekirdeği ve nükleolusa tanımlar. El, kullanarak ardışık time-lapse görüntüleri nükleolusa izlemekNIS Elements yazılımı gösterimler ve ölçümleri uygulama kökenli göç hızı ve mesafeyi belirlemek için. Ölçek çubukları = 100 mikron (A), 20 mikron (B). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Morfoloji ve Göç Denemelerde HUVECler kullanma.
HUVEC içinde EB3 etiketli MT büyüme dinamiklerinin Canlı hücre görüntüleme daha sonra bir ECM sinyal işaret atanabilir şekilde MT büyüme ve HUVEC morfolojisi değişiklikleri ölçmek ve değerlendirmek amacıyla uygun ve tekrarlanabilir hücre kültürü koşulları gerektirir. HUVECler hücre şekli ve hareketliliği incelemek için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Onlar hem çözülebilir hem de fiziksel bir sinyal uyaranlara yanıt olarak dramatik morfolojileri sergileyen, floresan etiketli cDNA transfeksiyon son derece uygundurlar ve, uygun hücre kültürü koşullarının 65-70 Resim vasküler tüplere kendilerini düzenleme yeteneğini korur. Böyle HUVEC olarak primer hücre kültürleri, hücreler sağlıklı olmasını sağlamak amacıyla ve deney sırasında normal davranacaktır dikkatli kullanım ve hücre geçiş sayısının izlenmesini gerektirmektedir. Örneğin, cytoskele araştıran deneylerHUVECler, tipik olarak on beş geçiş on yaklaşık eşit olmayan morfolojilerini görüntülemek için başlarken ton ve / veya hücre morfolojisi, HUVECler, onuncu hücre kültür geçişi ötesinde deneyler için kullanılmamalıdır.
Hücre yoğunluğu HUVEC sağlık ve çoğalmasının kritik bir düzenleyicisidir. HUVEC dallanma araştırmalar (yukarıdaki protokole 10,1-10,4 bakınız) hücreler ECM ile etkileşim fiziksel alan sağlamak ve dallı uzantıların uzatmak için, nispeten düşük hücre yoğunluğu kültürleri kullanmak. Buna karşılık, yara-kenar göç çalışmalarında, HUVECler önce yaralama bir tek tabaka kültürü (Protokol 10,5-10,8 bakınız). Bu tür, yara-kenar HUVECler nispeten un-dallı morfolojisi görüntüler gibi, kenar çıkıntıları önde gelen genişletmek ve onlar yara içine göç olarak yakın komşuları ile hücre-hücre etkileşimleri sergiler.
Uyarılar ve Yaşam HUVEC içinde Takibi MT Dynamics Avantajları.
Disk mikroskobu Spinning için mükemmel bir yaklaşımdıryüksek zaman çözünürlüklü konfokal görüntü netliği gerektiren deneysel hipotezleri test. Uygun kamera ve lazer modülü ile, bu mikroskopi yaklaşım düşük emisyonlu floresan duyarlı ve floresan mikroskobu diğer türlerine oranla azalmış photobleaching yardımcı olabilir. Farklı hücre tipleri çok çeşitli, EB3 etiketleme yaklaşımı kullanılarak MT büyüme dinamiği kapsamlı ölçümler oluşturmak için gerekli olduğu gibi da önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda da yüksek zaman çözünürlüklü görüntüleme orta için uygundur.
etiketleme EB3 metodolojisi MT artı uçları büyürken floresan etiketleme MTS diğer yöntemlere göre belirgin avantajları vardır, o da benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, aktif sökülmesi MTS nüfus ve stabil olmayan, dinamik MTS 71-74 nüfusu hem de dahil olmak üzere herhangi bir zamanda büyümemesi MT dizisinin bir bölümü vardır. EB3 MTS bu iki popülasyonlarının etiket olmaz veBu nedenle bu iki nüfus katkısı deneysel veri analizi dahil olmaz. Tüm MT diziyi değerlendirmek için alternatif yöntemler floresan etiketli MTS tüm toplumlarda içine birleştirir ve büyüyen küçülen tanımlanması için izin veren tubulin, ve durağan MTS ifadesi üzerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, tüm MT dizi etiketleme mikrotübül organizasyon merkezi, (MTOC) hücrenin merkezi ve bitişik Mt tadını nispeten yüksek yoğunluğu hücre civarındaki MT uçlarının görüntü analizi bir dezavantaj yaratmaktadır periferi 75-77. Canlı hücrelerde floresan tubulin ve floresan EB3 ile MTS iki renkli ko-etiketleme kullanarak deneyler tübülin etiketli MTS büyük çoğunluğu da EB3 etiketli 78 olduğunu, niteliksel, ortaya koymuştur. Buna ek olarak, floresan tubulin ile etiketlenmiş MTS otomatik izleme etkili bir yöntem olmamıştır. Bu, araştırmada veri toplama demektiryon ve floresan tubulin ifade eden hücrelerde MT dinamiklerinin ölçümleri, hata eğilimli ve sıkıcı bir süreç bireysel MTS el izleme gerektirir. Bunun bir sonucu olarak, EB3 etiketli MTS otomatik hesaplama analizi, çok sayıda hücre türleri arasında ve deneysel rejimleri 35,79 çeşitli olan MT dinamikleri deney tatbik edilebilir MT dinamiklerini ölçmek için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir.
HUVEC Morfolojisi ve Göç MT Büyüme Dinamikleri Bağlama.
Bir iskelet araştırmacı açısından bakıldığında, plusTipTracker otomatik izleme analiz biri son derece yararlı adaptasyon ölçmek ve MT büyüme dinamikleri hem tam hücre ve bölgesel değişiklikleri değerlendirmek için yeteneğidir. Bir hücre polarize olmak şartı yönlü hücre göçü için önemli bir ön koşuldur. Böyle, polarize sinyal ipuçları uzun yönlü hücre migrasyonu 30,31,51,54,56,80,81 için önemli itici faktörleri olarak bilinmektedir olarak 2,82-87 VEGF cue doğru aktin polimerizasyonu MT büyümesini teşvik. Buna ek olarak, (örneğin, uyum ve boyut mechanosensing için) ECM ile fiziksel etkileşim yanıt olarak, HUVECler yerel MAP dallı uzantıların uzatılması olan MT büyümesini teşvik etmek için regüle ederek MT dinamiklerini modüle eden ve bu yönünde, HUVEC göçünün kılavuzlanmasına yarar işaret 5,31,88. Böylece, hücre dışı bir sinyal uyaranlara yanıt olarak polarizasyon iskelet dinamikleri lokalize değişikliklerin deneysel değerlendirilmesi gerekliliğini vurgulamaktadır.
(EB3 yaklaşımını kullanarak) MT büyüme dinamikleri ve HUVEC hücre göçü eşzamanlı canlı hücre görüntüleme MTS saniyelik bir zaman ölçeğinde büyümeye çünkü hücre morfolojisi ve yön göç değişiklikler saatlik bir zaman ölçeğinde meydana ederken, gerçekleştirmek son derece zordur. Oysa her iki süreç yakından linke vardırd. Ayrıca, ikinci kez ölçekte floresan etiketli EB3 sürekli, hızlı görüntüleme EB3 sinyalinin photobleaching yol açar. EB3 (1-2 dk edinme serisi) her 30 dakikada başarılı olmuş kısa görüntüleme serisi yaparak bu sorunu aşmak için çalışır, ancak sadece EB3 optimal ifade vardı EC küçük bir sayıda başarılı olabilir ve bu olumsuz görüntüler vermedi tekrarlanan lazer aydınlatma 5 etkileri.
MT büyüme dinamikleri hücre morfolojisi ve göç değişikliklere nasıl katkıda yorumlarıyla sağlayan alternatif bir yaklaşım Faiz (ROI) aracı 35 (Protokol 6.6 bakınız) plusTipTracker Bölgesidir. tüm hücre MT büyümesi alt bölünmüş MT büyüme parça daha sonra ayıklanır ve analiz edilebileceği kullanıcı tanımlı bölgeler, içine olmak izler Bu metodoloji sağlar. Örneğin, hücrenin "dallı olmayan" bölgelerde karşı "dallı" karşılaştırmaları MTs daha s büyümek olduğunu ortaya koymuşturaşağı ve daha fazla sürekli kollara ayrılmış bölgelerde dallanmamış hücre kenarına 5 ile karşılaştırıldığında. polarize yara kenarı HUVEC olarak, kenarı ve arka kenarı MT büyüme dinamiği karşılaştırmalar MCAK kaynaklı MT sökme arka kenarı kenarı olan spesifik inhibe değil, ortaya koymuştur. lider ve Rac1 ve / veya MCAK fosforilasyonu mutantlar ifade HUVEC kenar MT büyüme dinamiklerini firar Bölgesel değerlendirme ayrıca Aurora-A kinaz Rac1 kaynaklı aktivasyon özellikle ve yerel HUVEC kutuplaşma ve yön göç sürücü ön kenarında içinde MCAK aktivitesini inhibe ortaya 31. Böylece, MT büyüme dinamikleri ve dallı çıkıntılar ve / veya yara kenar HUVEC ön kenarına içinde MT büyüme dinamikleri bölgesel değerlendirilmesi otomatik izleme kombinasyonu bize HUVEC morfolojisi ve göç MT büyüme dinamiklerini bağlamak için izin verdi.
açıklanan protokoller designe vardırd HUVEC kültür ve deneysel araştırma için genellikle basit ve son derece tekrarlanabilir bir metodoloji sağlamaktır. Bununla birlikte, iletişim kuralı detayların bir çok da, deney yöntemi yapma hataları ya da zorluklar olanağı sağlayan, karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. protokol boyunca potansiyel sorunları çözmek için teşebbüs ederken, burada daha az yaygın ya da başka yöntem protokolleri içinde notlar olarak kısaltılır potansiyel problemlerin ek, ayrıntılı sorun giderme sağlanır.
poliakrilamid yüzeylerde ile kaplama lamelleri (Protokol 2.2), cam lamelleri aktive cam poliakrilamid bağlanması, poliakrilamid aktive ve daha sonra poliakrilamid için ECM bağlanması karmaşık doğası doğar ortak sorunu ile ilgili. Bir özellikle zor ve potansiyel olarak sorunlu bir adım Polya maruz kalmasını takiben fibronektin / poliakrilamid jel üzerine HUVECler kültürleme olduğunu2 mM sülfo-SANPAH için crylamide kaplı lamelleri (yukarıda adım 2.2.2.6). Bu yüzeylerde HUVECler kültürleme başarısı için kritik öneme sahiptir sülfo-SANPAH tamamen ECM birleştikten sonra deneysel sistemden çıkarılmalıdır. Bu en iyi GKD 2 O ile yıkama ve gece boyunca bir karıştırıcıda GKD 2 O lamelleri inkübe edilmesi ile gerçekleştirilebilir. poliakrilamid ECMs kültüre hücreleri hayatta değilse canlılığı, beklenen artış ve fibronektin (adım 2.2.2.9) konjugasyon sonra sülfo-SANPAH yıkanması tekrarlanan küçükse potansiyel bu sorunu hafifletmek veya tavsiye edilir.
Protokolün 3 (a lamel cDNA transfeksiyonu ve HUVEC kültür) İlgili, elektroporasyon prosedürün başarısı için büyük bir etkisi hücrelerinin trypsinization sırasında hem HUVEC'lerin ele tamamlanmasının ardından plastik şişeden bunları kaldırmak ve etmektir elektroporasyon (yukarıda, 3.3-3.4 adım). Bakım için kritik öneme sahiptirtripsin ve şişeye (genellikle 1-2 dakika) yüzeyi üzerinde "yuvarlak-up" hücreleri için gereken zamanı aşmayacak şekilde ise, tam HUVECler izler. Tripsin Aşırı zaman hücreleri fibronektin kaplı lamelleri (3.4 adım) üzerine kaplama ve daha sonra yüzeye tutunur başarısız kadar genellikle fark edilmez HUVEC ölüm, önemli bir nedenidir.
elektroporasyon tamponunda uzun süre askıya zaman benzer öneme sahip, HUVECler (ve çoğu primer hücre tipleri) iyi ücret yoktur. daha büyük ölçekli deneyler esnasında, kullanıcı elektroporasyon gerektiren beş veya daha fazla koşulu vardır, örneğin, tek-a-zaman, tek tek tüpler içinde pelet hücreleri (transfeksiyon başına 1 tüp) tutmak ve bunları karıştırmak için daha da elektroporasyon hemen önce elektroporasyon tamponu içinde. Bu yaklaşım elektroporasyon tampon ve en üst düzeyde HUVEC hayatta kalma kuluçka süresini en aza indirir. Ayrıca, tam bir kültür ortamında acil kurtarma de cr olduğunuitical Elektroporasyondan. Bir dakika ya da daha fazla, aşağıdaki elektroporasyon kurtarma gecikme tam HUVEC ölüme yakın neden olabilir ve bu nedenle kaçınılmalıdır.
İlgili hücre göçü deneyi (Protokol 9), son derece yüksek bir yoğunlukta HUVECler kültür tekniği fibronektin kaplı lamel kurutma gerektirir (protokol 3'te tarif edilmiştir), geleneksel HUVEC hücre kültürü metodolojisi (aşama 9.2'de anlatıldığı gibi) kritik bir değişiklik bağlıdır lamel çok küçük bir alana HUVEC kültürü sağlamak için. lamel tamamen kurutulur edilmemiştir ya da fibronektin ile lamel ön kaplama (adım 2.1 veya 2.2) halinde etkin değildi Çoğu zaman, örtücü kısım üzerine yerleştirilmiştir ortam ihtiva eden hücreler, yüzey gerilimini kaybeder ve genişleyecektir böylece lamel hücrelerin yoğunluğunu azaltarak, lamel kenarları. bu potansiyel sorunu gidermek için bir yöntem lamel ve ardından ortamı aspire etmektir5-10 dakika biyogüvenlik kabini arkasına (hala 35mm çanak) lamel yerleştirin. Bu uyarlama çanak kurutmaya yardımcı olmak için kabin içinde hava akışına izin vermek için yardımcı olabilir. gözle görülür sıvı hava kuruduktan sonra lamel kalırsa, sıvı noktalar aspire ve tekrar biyogüvenlik kabini 5-10 ek dakika kurumaya bırakın. Tamamen bu olası sorunu önlemek için bir yol olduğuna dikkat etmek önemlidir, ancak bu protokolün tekrarlanan uygulama ile bir sorun daha az hale gelir. Aynı zamanda hücre göçü deneyi (ya da genel olarak herhangi bir tahlil,) için lamelleri hazırlarken, ekstra lamelleri hazırlamak ve ekstra HUVECler hazır-to-go yol boyunca sorunları durumunda sahip olduğu bir sorun giderme öneridir.
Akılda bu sorun giderme hususlar ile, tartışılan protokoller ve gelecekteki hücre biyolojisi araştırmalarında onların etkileri faydasını vurgulamak için de önemlidir. polyacr uygulanabilirliğiilamid yaklaşım, geniş, ve (yukarıda tarif edilen) hücre-ECM angajman iki boyutlu çalışmalar, aynı zamanda, üç-boyutlu bir inceleme 5 de içerir. Bu uygulama HUVECler fizyolojik ortamlarda hücre şekli ve göçü düzenleyen nasıl anlayışımızı artırarak için kritik öneme sahiptir ve araştırmacılar, hücre iskeleti değişikliklerle koordine nasıl morfolojik değişiklikler temel bir anlayış sağlamalıdır. Burada anlatılan protokoller MT büyüme dinamikleri ölçümleri odaklanmış olsa da, protokollerin çoğunluğu ve hücre-ECM etkileşimleri diğer mikroskobik ölçülebilir yönleriyle herhangi bir sayı ölçmek için adapte edilmelidir olabilir. MT dinamikleri açısından, sunulan protokolleri kullanarak incelenebilir en az 14 kinesinlerin 89 ailelerine, HUVEC kutupluluk ve yönetmenliğini göç katkıda potansiyel rolü olan her ve tüm dahil, çok sayıda haritalar bulunmaktadır.
Gelecekteki araştırmalar gereken birLSO hastalıklı devletlerin karşı normal hücre ECM angajman hedeflenmelidir. Burada sunulan HUVEC protokolleri normal vasküler homeostatik süreçlerin soruşturmalara uygulanabilir yanı sıra birkaç isim, kalp hastalığı, retinopati, tümör büyümesi ve metastazı da dahil olmak üzere hastalık durumlarıyla vardır. endotel hücre vasküler anjiyojenez, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe ile izlenebilir şekilde hücre ECM birleştirme çalışmaları için sağlayacak mikroskopik çalışmaları ile müsait uyumu gözle saydam ECM ve poliakrilamid substratlar konjüge. Deneysel yaklaşımlara Bu tür zaten önemli endotel hücre şekli, polarite, göç farklılıkları ve bu süreçleri 5,31,90 düzenleyen proteinlerin etkilerini ortaya çıkarmak için başladı. Gelecek çabalar ECM uyum ve çok boyutluluk mechanosensing kombinasyonu hedef ve iskelet dinamiklerini düzenleyen yerel kontrol proteinlerine hizmet edebilir nasıl tespit hedeflemelidir.
Acknowledgments
plusTipTracker MT analiz yazılımı geliştirmek için rehberlik ve bu çalışmalarda kullanılan floresan cDNA yapıları birçok sağlamak için tartışmalar, Michelle Baird ve Mike Davidson Dr. Clare M. Waterman ve Kathryn Applegate ve Gaudenz Danuser özel teşekkürler. Bu eser dan KAM bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH). (Grant: 4K22HL113069).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
| 2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
| 3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
| 405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
| anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
| ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
| ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
| ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
| ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
| Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
| Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
| EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
| Fetal bovine serum 25 ml | |||
| Bovine brain extract 2.0 ml | |||
| Gentamycin sulfate 0.5 ml | |||
| Epidermal growth factor 0.5 ml | |||
| Hydrocortisone 0.5 ml | |||
| Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) 10.0 ml | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
| Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
| HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
| HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
| Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
| Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
| Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
| Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
| Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
| Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
| Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
| Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
| Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) | MP Biomedicals | 91670249 | |
| Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| plusTipTracker | |||
| Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
| Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
| Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
| Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
| Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin | Corning | MT25053CI | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |
References
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
- Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
- Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
- Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
- Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
- Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
- Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
- Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
- Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
- Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
- van Veen, M. P., van Pelt, J.
- Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
- Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
- Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
- Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
- Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
- Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
- Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
- Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
- Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E.
- Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
- Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
- Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
- Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
- Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
- Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
- Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
- Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
- Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
- Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
- Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
- Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
- Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138 (2014).
- Waterman-Storer, C. M.
- Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M.
- Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
- Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
- Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
- Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
- Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
- Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
- Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
- Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
- Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
- Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
- Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
- Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
- Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
- Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
- Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
- Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
- Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
- Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266 (2013).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636 (2013).
- Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C.
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
- Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601 (2012).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
- Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
- Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
- Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
- Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
- Wiese, C., Zheng, Y.
- Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
- Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
- Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
- Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569 (2013).
- Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
- Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
- Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
- Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833 (2013).
- Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).
